Encyclopédie des expériences JoVE
Immunologie
0 vues • 3:32 min • July 8th, 2025
Prenez une plaque de micropuits recouverte de fragments de fibronectine recombinante et ajoutez-y des lymphocytes T CD8 positifs murins activés.
Introduire des vecteurs rétroviraux contenant un ARN transgénique qui code pour un récepteur antigénique chimérique ou CAR.
Couvrez l’assiette et scellez-la dans un sac pour éviter toute contamination. Centrifuger la plaque à basse vitesse pour faciliter l’interaction virus-cellule.
La fibronectine se lie au virus et à la cellule, les colocalisant pour améliorer le transfert de gènes médié par le virus.
Après la centrifugation, retirer le sac scellé et incuber la plaque dans des conditions physiologiques.
L’enveloppe du vecteur viral fusionne avec la membrane cellulaire, libérant l’ARN viral et les enzymes.
Les enzymes virales inversent la transcription de l’ARN libéré et intègrent l’ADN résultant dans le génome de l’hôte, permettant aux cellules d’exprimer des CAR liés à la surface.
Le CAR comprend un domaine de liaison à l’antigène spécifique à l’antigène cible et des domaines de signalisation pour l’activation des lymphocytes T.
Les cellules CAR-T spécifiques de l’antigène sont prêtes pour les tests en aval.
Le jour 1, préparez des plaques recouvertes de fragments de fibronectine humaine en ajoutant 0,5 millilitre de fibronectine dans les puits d’une plaque à 24 puits et en l’incubant pendant la nuit à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, retirez la solution de fibronectine et ajoutez 1 millilitre de BSA à 2 % dans du PBS par puits. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes et laver les puits traités avec 1 millilitre de PBS stérile. La plaque est prête à l’emploi après avoir retiré la solution de lavage.
Comptez les lymphocytes T CD8 activés à l’aide du bleu trypan. Collectez-les par centrifugation et mettez-les en suspension à 5 millions de cellules viables par millilitre pour la transduction. Ajoutez 100 microlitres de suspension de cellules CD8 activées dans chaque puits de la plaque recouverte de fibronectine. Ensuite, ajoutez 1,5 à 2 millilitres du milieu contenant le virus préalablement préparé et mélangez en utilisant un mouvement tourbillonnant pour distribuer uniformément les cellules.
Fermez la plaque dans un sac à fermeture éclair et centrifugez-la à 2000 fois g pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Retirez la plaque de la centrifugeuse et apportez-la dans une enceinte de sécurité biologique. Retirez soigneusement le sac en plastique et assurez-vous que l’extérieur de la plaque n’est pas contaminé par du fluide. Transférez la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.
Après 4 heures, retirer 1 millilitre de milieu de chaque puits. Remplacez-le par 1 millilitre de milieu à cellules T complètes préchauffé et remettez la plaque dans l’incubateur.