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Commencez par une culture de cellules souches de moelle osseuse.
Introduisez le tampon trypsine-EDTA pour détacher les cellules et briser les amas cellulaires, formant une suspension unicellulaire.
Centrifugez, puis retirez le surnageant. Remettez le granulé en suspension avec un milieu frais.
Transférez la suspension dans une seringue et connectez-la à une unité de filtre à membrane.
Poussez le piston et jetez le fluide contenant le filtrat.
Détachez le filtre. Remplissez la seringue avec un produit frais. Connectez à nouveau le filtre et poussez rapidement le piston.
La pression du liquide force la cellule vers les pores du filtre.
Cela produit une vésicule sphérique à membrane plasmique ou PMV.
Ces vésicules contiennent des composants cellulaires et des organites entourés par la membrane.
Examinez le filtrat à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé pour observer les vésicules sphériques translucides.
Les dimensions des vésicules correspondent à la taille des pores de la membrane filtrante, ce qui confirme la génération de VP.
Pour générer les PMV, il faut d’abord cultiver des PMSC de souris dans un milieu de culture DMEM complet dans un puits d’une plaque à six puits dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules ont atteint 90 % de confluence, rincez le puits avec 0,5 millilitre de PBS sans calcium et détachez les cellules avec 0,5 millilitre de trypsine-EDTA à 0,25 %.
Après trois minutes à 37 degrés Celsius, tapotez la plaque avec la paume de la main plusieurs fois pour faciliter la dissociation cellulaire et arrêtez la digestion avec 1 millilitre de milieu de culture. Transférez les cellules dans un tube conique de 5 millilitres pour la centrifugation et remettez en suspension la pastille dans 4 millilitres de milieu de culture frais. Ensuite, divisez les cellules entre deux puits d’une nouvelle plaque à six puits et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.
Le lendemain, récoltez les cellules d’un puits par digestion à la trypsine, comme nous venons de le démontrer, en remettant en suspension la pastille dans 0,5 millilitre de milieu de culture frais après collecte par centrifugation. Chargez les cellules dans une seringue à insuline de 1 millilitre et fixez la seringue à une unité de filtration. Appuyez rapidement sur le piston pour faire passer les cellules à travers le filtre et jetez le fluide extrudé. Ensuite, chargez et distribuez 0,5 millilitre de milieu de culture supplémentaire à travers le filtre, comme nous venons de le démontrer, en recueillant le milieu de la deuxième extrusion.
Grainez 150 microlitres du milieu collecté dans un plat à fond en verre de 35 millilitres et laissez les vésicules se déposer pendant environ 10 minutes. Ensuite, confirmez la présence de PMV sous un microscope à contraste de phase inversé équipé d’une caméra CCD à l’aide d’un objectif 20x.