Administration orale de cellules de levure transformées dans le système immunitaire intestinal de souris

Commencez par un tube oral contenant une suspension de levures auxotrophes génétiquement transformées qui sont incapables de produire une nucléobase d’uracile.

Insérez le tube buccal dans la bouche d’une souris immobilisée et guidez-le vers l’estomac.

Administrez la suspension de levure directement dans l’estomac, ce qui lui permet d’atteindre l’intestin grêle.

L’intestin grêle contient des cellules épithéliales, avec des plaques de Peyer sous-jacentes riches en cellules immunitaires.

Les cellules microplisées, des cellules épithéliales intestinales spécialisées près des plaques de Peyer, engloutissent les cellules de levure et les internalisent dans des vésicules.

Ces vésicules se déplacent à travers les cellules et libèrent des cellules de levure dans le patch de Peyer sous-jacent.

Isolez la plaque de Peyer de l’intestin de souris sacrifié et obtenez une suspension cellulaire uniforme.

Cultivez cette suspension cellulaire sur un milieu sélectif de levure contenant de l’uracile.

La levure auxotrophe utilise l’uracile et se multiplie pour former des colonies, confirmant ainsi l’administration de cellules de levure transformées dans le système immunitaire intestinal de la souris.

Après avoir préparé les cultures de levure selon le protocole textuel, utilisez un hémocytomètre pour déterminer la concentration cellulaire et ajustez à 10 à la neuvième cellule par millilitre. Granulez les cellules par centrifugation à 2 500 fois g pendant trois minutes. Ensuite, versez le surnageant et remettez les cellules en suspension en ajoutant le volume approprié d’eau stérile et en pipetant doucement de haut en bas.

Fixez une aiguille de gavage de calibre approprié sur une seringue stérile de 1 millilitre et chargez l’échantillon de levure en éliminant toute bulle d’air. Chargez une seringue supplémentaire avec de l’eau stérile pour gaver les souris témoins. À l’aide de la main non dominante, prenez la souris à gavager, et avec l’index et le pouce, saisissez fermement la peau autour du cou. Rentrez la queue sous le petit doigt. Assurez-vous que la poignée est bien fixée et qu’elle empêche la souris de bouger la tête.

Ensuite, insérez doucement l’aiguille de gavage dans l’œsophage de la souris en inclinant l’aiguille le long du toit de la bouche et à l’arrière de la gorge, en gardant légèrement à gauche du centre. Attendez que la souris avale le bulbe de l’aiguille. Si une résistance est ressentie ou si la souris halète, retirez doucement l’aiguille et essayez à nouveau de trouver l’œsophage.

Une fois que la souris a avalé le bulbe de l’aiguille gavée, appuyez doucement sur le piston de la seringue pour administrer la levure directement dans l’estomac de la souris. Retirez délicatement l’aiguille de gavage de l’estomac et de l’œsophage de la souris et remettez la souris dans la cage. Vérifiez que la souris respire et bouge normalement pour vous assurer que le gavage a été effectué correctement.

Après avoir sacrifié la souris selon le protocole de texte, positionnez-la avec l’abdomen complètement exposé et utilisez de l’éthanol à 70 % pour pulvériser la zone abdominale. Avec des ciseaux, faites une incision transversale à travers la fourrure et la peau. Ensuite, ouvrez manuellement l’incision pour exposer davantage le péritoine, la fine muqueuse séreuse qui recouvre les organes abdominaux. Soulevez doucement le péritoine et faites une incision transversale pour exposer les intestins.

Ensuite, utilisez une pince émoussée pour éloigner soigneusement l’intestin grêle des artères mésentériques, de la graisse et d’autres tissus. Exposez l’intestin grêle de l’estomac dans le quadrant supérieur gauche de l’abdomen de la souris au cæcum, la grande poche de tissu intestinal au début du gros intestin.

Ensuite, isolez les plaques de Peyer en recherchant des plaques de tissu opaque grossièrement circulaires de 1 à 2 millimètres le long de l’intestin grêle. Ensuite, à l’aide de ciseaux de dissection incurvés, découpez le dôme de la tache de Peyer, en laissant des marges pour s’assurer qu’aucun tissu environnant n’est collecté.

Transférez les patchs de Peyer disséqués dans l’IMDM complet. Ensuite, versez la solution avec des patchs de Peyer en suspension sur une passoire à cellules de 40 micromètres. Après avoir lavé les patchs de Peyer avec un IMDM complet, utilisez un piston d’une seringue de 1 millilitre pour briser doucement le tissu et recueillir les cellules dans un tube de 50 millilitres. Granulez les cellules tendues à 1 800 tr/min pendant sept minutes. Attendez ensuite et analysez les cellules selon le protocole de texte.