Génération de neutrophiles associés aux tumeurs anti-angiogéniques

Prenons l’exemple d’un mélanome murin composé de neutrophiles associés à la tumeur, ou TAN.

Les TAN présentent une activité élevée de l’enzyme nicotinamide phosphoribosyltransférase, ou NAMPT, stimulant l’angiogenèse, la prolifération des vaisseaux sanguins dans les tumeurs et facilitant la croissance tumorale.

Hachez le tissu et ajoutez des enzymes pour dégrader la matrice tissulaire, détachant ainsi les cellules.

Filtrez la suspension à travers une crépine et une centrifugeuse pour granuler les cellules.

Ajoutez un tampon de lyse pour lyser les globules rouges, puis centrifugez et jetez le surnageant contenant des débris cellulaires.

Introduire des anticorps pour bloquer les récepteurs cellulaires Fc, évitant ainsi l’immunocoloration non spécifique.

Introduire un cocktail d’anticorps marqués au fluorophore spécifique pour les marqueurs de surface sur les TAN et un colorant pour discriminer les cellules mortes.

À l’aide du FACS, isolez les TAN viables marqués au fluorophore et transférez-les sur une microplaque.

Ajoutez un inhibiteur bloquant l’activité de NAMPT aux puits sélectionnés et incuberez.

Utilisez les cellules pour évaluer leur capacité de stimulation de l’angiogenèse. Les TAN traités par inhibiteur présentent une angiogenèse réduite par rapport aux TAN non traités.

Pour l’isolement des neutrophiles associés à la tumeur, placez cinq tumeurs par puits dans des puits individuels d’une plaque stérile à six puits, au fur et à mesure qu’elles sont récoltées, et utilisez des ciseaux stériles pour hacher les tumeurs en morceaux de 2 à 3 millimètres. Ensuite, digérez les fragments de tumeur avec 1 millilitre de solution de collagénase sur disque, DNase I pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avec de l’humidité, en mélangeant les échantillons avec une seringue de 10 millilitres toutes les 15 minutes.

À la fin de l’incubation, filtrez les cellules à travers des passoires de 100 micromètres dans un tube de 15 millilitres par puits pour éliminer les fibres non digérées, et ajoutez du PBS à un volume final de 15 millilitres. Récupérez les cellules dissociées par centrifugation et lysez les globules rouges avec 1 millilitre de tampon de lyse par tube.

Après le mélange, combinez le contenu de chaque tube en un seul tube de 15 millilitres, en arrêtant la réaction après deux minutes avec 11 millilitres de milieu complet à 4 degrés Celsius. Après la centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de PBBS et bloquer toute liaison non spécifique avec trois microlitres d’anticorps bloqués par FC pendant 15 minutes sur de la glace.

À la fin de l’incubation, étiqueter les cellules avec des anticorps anti-CD11b et Ly6G et tout autre anticorps d’intérêt plus le DAPI pour une incubation de 30 minutes sur glace à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, laver les cellules dans 14 millilitres de PBS et remettre les granulés en suspension à raison de 1 x 10⁷ cellules par millilitre de concentration de milieu frais complet sur de la glace.

Ensuite, triez les neutrophiles CD11b positifs Ly6G-high DAPI-negative sur un trieur de cellules activé par fluorescence selon les protocoles de tri standard, en vérifiant la pureté des neutrophiles isolés sur le cytomètre en flux à la fin du tri. Pour l’inhibition des neutrophiles associée à la tumeur in vitro, ensemencez 1,5 fois 10 à la cinquième des neutrophiles triés dans chacun des deux puits d’une plaque à fond en U de 96 puits, et ajoutez FK866 à une concentration finale de 100 nanomolaires dans un milieu complet dans un puits et un volume égal de milieu complet seul dans l’autre puits. Après deux heures dans l’incubateur de culture cellulaire, laver les cellules deux fois avec du PBS et remettre les granules en suspension dans du PBS à la concentration appropriée pour l’injection ultérieure.