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Immunologie
0 vues • 3:12 min • July 8th, 2025
Commencer par une suspension de Mycobacterium bovis BCG, traitée avec un tensioactif non ionique, pour éviter l’agglutination bactérienne.
Ensuite, ajoutez un réactif de biotinylation et incuber.
Ce réactif de biotinylation, un complexe de biotine complexé à un linker fonctionnel, facilite la liaison des molécules de biotine aux protéines de surface bactériennes, marquant ainsi les bactéries.
Après l’incubation, centrifuger la suspension bactérienne marquée à la biotine pour éliminer le réactif de biotinylation n’ayant pas réagi.
Remettez les bactéries en suspension dans un tampon. Ajouter une solution de protéine de fusion d’avidine, une protéine recombinante comprenant un domaine antigénique cible fusionné à de l’avidine monomère.
Pendant l’incubation, l’avidine se lie à la biotine, facilitant la modification de la surface bactérienne avec les antigènes cibles.
Centrifuger la suspension pour éliminer les protéines de fusion non liées.
Remettre en suspension les bactéries enrobées d’antigène dans un tampon contenant un tensioactif non ionique. L’enrobage antigénique de la bactérie peut améliorer sa propriété à déclencher des réponses immunitaires.
Travailler dans une enceinte de biosécurité à l’aide d’un équipement de protection individuelle, car le BCG est un agent pathogène de niveau II.
Pour biotinyler la surface des cellules BCG, cultivez d’abord les cellules sur une plate-forme agitée à la bonne densité. Collectez environ 1 milliard de cellules et lavez-les trois fois à l’aide de 500 microlitres de PBST glacé sans endotoxines. Ensuite, faites tourner les cellules et suspendez-les dans du PBS stérile sans endotoxines. Ensuite, préparez de la biotine fraîche Sulfo-NHS SS de 10 millimolaires dans de l’eau filtrée stérile. Ensuite, incubez les bactéries dans 1 millilitre de bouillon contenant 0,5 millimolaire de biotine Sulfo-NHS SS. Effectuez l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes.
Ensuite, lavez trois fois les bactéries maintenant étiquetées avec 500 microlitres de PBST glacé, pour éliminer le réactif qui n’a pas réagi. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de PBST.
Mélangez 500 millions de BCG biotinylés avec de la protéine de fusion d’avidine, pour une concentration finale de 10 microgrammes de protéines par millilitre. Laissez cette réaction se dérouler pendant une heure à température ambiante sur un shaker. Ensuite, lavez les bactéries trois fois avec 500 microlitres de PBST glacé.