Procédé de traitement à haute teneur en sel de cellules dendritiques et de leur transfert adoptif chez la souris
JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologie
0 vues • 3:16 min • July 8th, 2025
Commencez avec une plaque multipuits contenant une suspension de cellules dendritiques ou DC.
Pour imiter un état hypertensif, ajoutez un milieu de culture contenant une forte concentration d’ions sodium et incubez.
Pendant l’incubation, les ions sodium pénètrent dans la cellule, augmentant la concentration intracellulaire de sodium.
Cela déclenche l’échange d’ions sodium intracellulaires avec des ions calcium extracellulaires.
L’augmentation des niveaux internes de calcium active les voies qui facilitent la génération d’aldéhydes réactifs, qui se lient aux protéines cellulaires. Cela active les DC, qui affichent ces protéines modifiées à leur surface.
Après l’incubation, recueillir les cellules dans un tube et centrifuger.
Retirez le surnageant. Ajoutez un nouveau tampon pour remettre les cellules en suspension.
Aspirez la suspension cellulaire dans une seringue.
Prenez une souris anesthésiée et injectez la suspension cellulaire rétroorbitale, c’est-à-dire une zone située derrière l’orbite.
Ce processus d’injection de cellules immunitaires activées est appelé transfert de cellules adoptives.
Pipetez 900 microlitres de la suspension DC dans une plaque de faucon plate à fond plat de 24 puits. Ajoutez 100 microlitres de milieu de culture à haute teneur en sel DC dans chaque puits pour une concentration finale en sodium de 190 millimolaires. Étiquetez l’assiette et placez-la dans un incubateur de dioxyde de carbone humidifié à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.
Après 48 heures, retirez la plaque de l’incubateur. Essuyez le milieu de culture cellulaire dans un seul puits de haut en bas pour remettre en suspension les CD CD11c positifs. Transférez toute la suspension dans un tube de 1,6 millilitre étiqueté correspondant. Répétez cette opération pour chaque puits individuel qui a été plaqué.
Centrifugez tous les tubes à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez le surnageant et remettez en suspension la pastille DC avec 100 microlitres de DPBS stérile. Ensuite, aspirez la solution DC de l’un des tubes dans une seringue de 1 millilitre équipée d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27.
Placez la souris mâle naïf, âgée de 10 semaines, C57 black six sous 2 % d’isoflurane pour obtenir un plan chirurgical stable. Vérifiez le niveau d’anesthésie avec l’absence de réflexe de pédale. Une fois qu’un plan chirurgical stable est atteint, introduisez lentement et soigneusement l’aiguille dans l’espace rétro-orbitaire à un angle d’environ 30 degrés.
Lentement et en douceur, injectez la suspension DC positive CD11c. Une fois l’injection terminée, retirez soigneusement l’aiguille de l’espace rétro-orbitaire en veillant à ne pas endommager l’œil. Ensuite, retirez les souris du cône nasal et surveillez-les pendant environ 30 minutes pendant la récupération de l’anesthésie.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant d'activer des cellules dendritiques (DCs) dans des conditions d'hypertension artérielle et leur utilisation ultérieure dans un transfert adoptif de cellules. Le processus implique la modulation des concentrations en ions sodium et calcium afin d'activer les cellules dendritiques, qui sont ensuite injectées chez des souris.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Immunologie
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
Contexte
- Les cellules dendritiques jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire.
- Les conditions hypertensives peuvent influencer les activités cellulaires.
- Le transfert adoptif de cellules est une technique utilisée pour renforcer les réponses immunitaires.
- Comprendre les échanges ioniques dans les cellules est essentiel pour manipuler les fonctions immunitaires.
Objectif de l'étude
- Étudier les effets de la concentration en ions sodium sur l'activation des cellules dendritiques.
- Illustrer le processus de transfert adoptif de cellules chez la souris.
- Explorer les implications des cellules dendritiques activées dans les réponses immunitaires.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une suspension de cellules dendritiques dans une plaque multipuits.
- Incubation avec un milieu de culture à concentration élevée de sodium.
- Centrifugation et resuspension des DC activées.
- Injection des DC dans l'espace rétro-orbitaire de souris anesthésiées.
Résultats principaux
- Une augmentation du sodium intracellulaire entraîne une élévation des concentrations de calcium dans les DC.
- Les DC activées exposent des protéines modifiées à leur surface.
- Une injection réussie de DC activées chez des souris a été réalisée.
- La méthode illustre une approche viable pour l'étude des réponses immunitaires.
Conclusions
- La présente étude fournit des informations sur les mécanismes d'activation des cellules dendritiques.
- La technique de transfert adoptif de cellules peut être utilisée pour des études immunologiques supplémentaires.
- De futures recherches pourraient explorer les applications thérapeutiques des CD activées.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une interrogation mécanistique de l'activation des cellules dendritiques dans des conditions de stress hypertensif, offrant un système contrôlé pour étudier la modulation immunitaire médiée par les ions. En générant des néoantigènes définis par la formation d'adduits entre l'isolevuglandine et les protéines, elle soutient la validation de cibles dans des modèles de maladies auto-immunes et inflammatoires. Le protocole de transfert adoptif propose une approche reproductible pour l'évaluation préclinique de stratégies immunomodulatrices basées sur les cellules dendritiques.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'explorer les voies d'échange ionique sodium-calcium en tant que moteurs mécanistiques de l'activation des cellules dendritiques.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole standardisé pour générer des cellules dendritiques présentatrices d'antigènes avec une charge définie en néoantigènes, destiné à la vérification d'hypothèses.
- Valeur prédictive : Contribue à l'atténuation des risques associés aux cibles immunomodulatrices en reliant le stress ionique à la réponse fonctionnelle des cellules dendritiques in vivo.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère des cellules dendritiques activées présentant à leur surface des adduits protéiques à l’IsoLG, quantifiables par cytométrie en flux ou par imagerie.
- Reproductibilité : Une concentration définie de sodium (190 mM) et un temps d’incubation (48 h) permettent une activation reproductible des cellules dendritiques entre les expériences.
- Extensibilité : Le format en plaque multipuits permet le traitement parallèle de différentes conditions pour le criblage comparatif d’adjuvants ou de modulateurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pathologique : Modélise la dysrégulation immunitaire associée à l'hypertension, pertinente pour les comorbidités cardiovasculaires et inflammatoires.
- Continuité translationnelle : Le transfert adoptif de DC activées permet le suivi des réponses des lymphocytes T spécifiques de l'antigène dans des modèles murins.
- Utilité préclinique : Permet l'évaluation d'interventions basées sur les DC dans des modèles d'auto-immunité ou de rejet de greffe aggravés par l'hypertension.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la continuité découverte-préclinique en fournissant un outil permettant de valider des mécanismes centrés sur les cellules dendritiques avant d'investir dans des candidats thérapeutiques coûteux.
- Découverte en biologie : Évalue comment le flux ionique influence la maturation des DC et la présentation des antigènes, précisant les liens mécanistiques entre l'hypertension et l'activation immunitaire.
- Criblage : Fournit des DC activées quantifiables et standardisées pour le criblage de composés modulant les canaux ioniques ou les voies de détoxification des aldéhydes.
- Analytique : Permet la mesure des marqueurs d'activation des DC, de la charge en néo-antigènes et de la prolifération des lymphocytes T en aval comme paramètres fonctionnels.
- Recherche translationnelle : Facilite l'évaluation préclinique de thérapeutiques ciblant les DC dans des modèles où un déséquilibre ionique contribue à la pathogenèse.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole peut être adapté à différentes souches murines et sous-populations de DC afin de constituer une plateforme réutilisable pour les études en immunométabolisme.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Désamorçage mécanistique des voies d'activation des cellules dendritiques par modélisation définie du stress ionique.
- Valeur opérationnelle : Génération standardisée et reproductible de cellules dendritiques présentant des néoantigènes, pour des entrées expérimentales cohérentes.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions de poursuite ou d'abandon de cibles immunomodulatrices en associant les stress physiologiques aux réponses immunitaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des thérapies basées sur les cellules dendritiques dans les indications de recouvrement cardiovasculaire et immunitaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans l'isolement des cellules dendritiques, leur culture et la validation par cytométrie en flux des marqueurs d'expression membranaire.
- Dépend d'un incubateur CO2, d'une centrifugeuse et d'un matériel pour injections rétro-orbitaires avec surveillance de l'anesthésie.
- Implique une standardisation de la pureté du chlorure de sodium et des contrôles d'osmolarité entre laboratoires.
- L'adaptation aux sous-populations de cellules dendritiques humaines peut nécessiter une optimisation de la tolérance au sodium et des méthodes de détection des adduits.
- Limité aux modèles murins ; l'extrapolation à la physiologie humaine exige la validation de voies ionosensibles analogues.
F.A.Q. sur les biopharmaceutiques
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Dernière mise à jour : 22 août 2026