Génération de lymphocytes T CD8 positifs uniques à partir de cellules souches pluripotentes induites

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunologie

0 vues • 6:08 min • July 8th, 2025

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Cellules souches pluripotentes induites par la culture sur une couche nourricière de cellules stromales sur une matrice de gélatine.

La couche nourricière imite l’environnement extracellulaire naturel, guidant la différenciation des cellules souches en organoïdes en forme de dôme contenant des cellules progénitrices hématopoïétiques.

Ajoutez des enzymes pour dissocier les cellules co-cultivées.

Transférez les cellules dans une boîte fraîche enrobée de gélatine pour l’adhésion des cellules stromales.

Prélever les cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes dans un milieu de différenciation.

Cultivez-les sur une couche nourricière fraîche pour favoriser la différenciation des cellules progénitrices en lymphocytes T doublement positifs avec des récepteurs CD4 et CD8 et en lymphocytes T doublement négatifs dépourvus des deux récepteurs.

Transférez les cellules dans un tube. Incuber-les à l’aide de billes magnétiques porteuses d’anticorps spécifiques aux CD4 qui marquent sélectivement les lymphocytes T doublement positifs.

Utilisez un séparateur magnétique pour isoler les cellules doublement positives et les cultiver sur une couche nourricière fraîche.

Complétez avec un mélange de cytokines et d’anticorps pour stimuler les cellules, induire une régulation négative des récepteurs CD4 et favoriser leur différenciation en cellules CD8-single positives.

Préparer des plats gélatinisés OP9-delta-1 une semaine avant la co-culture avec des IPSC humains. Ajoutez 4 millilitres de gélatine à 0,1 % dans trois nouvelles boîtes de culture cellulaire et incubez-les pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, aspirez la gélatine et ajoutez 8 millilitres de milieu OP9 dans chaque plat. Passage d’une boîte confluente de cellules OP9-delta-1 dans trois boîtes recouvertes de gélatine.

Après quatre jours, ajoutez 10 millilitres de milieu OP9 dans chaque boîte de cellules, pour un total de 20 millilitres de milieu par boîte. Commencer la co-culture IPSC humaine sur des boîtes de confluence OP9-delta-1 sept à huit jours après le passage des cellules. Aspirez le média d’une parabole confluente d’IPSC humains et ajoutez 10 millilitres de média OP9.

Coupez et détachez les colonies cellulaires à l’aide d’un outil de passage cellulaire jetable, puis transférez 350 à 600 amas de colonies coupées dans une boîte OP9-delta-1 prégélatinisée avec 10 millilitres de milieu OP9 frais. Secouez le plat de culture d’un côté à l’autre et d’avant en arrière pour assurer une répartition uniforme des colonies. Le lendemain, aspirez le support usagé et remplacez-le par 20 millilitres de support OP9 frais.

Les amas humains d’IPSC co-cultivés sur OP9-delta-1 pendant une journée devraient apparaître sous la forme de petites colonies monocouches rondes. Le jour 5, aspirez 10 millilitres de média usagé et ajoutez 10 millilitres de média OP9 frais. Les colonies commenceront à se différencier en mésoderme primitif, qui se caractérise par un centre sombre multicouche.

Répétez ce processus le jour 9, après quoi les structures centrales multicouches évolueront en formes de dôme. Récoltez les cellules progénitrices hématopoïétiques le 13e jour, moment où les structures sont composées d’un organoïde central sombre entouré d’un réseau de zones en forme de dôme. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 5 millilitres de solution saline équilibrée Hank’s 1x sans rouge de phénol avec du calcium et du magnésium ou HBSS.

Après le lavage, ajoutez 250 microlitres de 5 000 unités par millilitre de collagénase-4 à 10 millilitres de HBSS. Ajoutez le mélange dans les cellules et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Aspirez le mélange HBSS-collagénase et lavez une fois les cellules avec 5 millilitres de PBS. Après le lavage au PBS, ajoutez 5 millilitres de trypsine-EDTA à 0,25 % et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, ajoutez 4 millilitres de média OP9, et associez la couche cellulaire par pipetage pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une crépine de 100 micromètres, et centrifugez le tube à 300 fois g et 4 degrés Celsius pendant 5 minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu OP9.

Placez la suspension cellulaire sur une nouvelle boîte de culture cellulaire gélatinisée de 10 centimètres et incuberez-les à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes. Ensuite, prélevez toutes les cellules non adhérentes par pipetage doux. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres à travers une crépine et centrifugez comme décrit précédemment. Ensuite, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu de différenciation.

Placez la suspension cellulaire sur une nouvelle parabole confluente OP9-delta-1. Passez les cellules le 16e jour selon les instructions du manuscrit, et continuez à passer les cellules non adhérentes tous les cinq à sept jours par la suite. Après 35 jours de différenciation, enrichir la population de cellules CD4-positives par isolement des billes magnétiques CD4 selon le protocole du fabricant.

Ensuite, mettez les cellules en suspension dans un milieu OP9 et plaquez 1 millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à fond plat à 24 puits de culture tissulaire de confluent OP9-delta-1. Stimulez les cellules en ajoutant 100 unités internationales d’IL-2 humaine, 5 nanogrammes d’IL-7 humaine, 500 nanogrammes d’anticorps CD3 anti-humains et 2 microgrammes d’anticorps CD28 humains dans chaque puits. Après quatre à sept jours, les cellules peuvent être prélevées pour une analyse plus approfondie.

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Dernière mise à jour : 15 août 2026