Culture de neurones excitateurs fluorescents à partir du cerveau d’un bébé souris transgénique

Prenez le cerveau d’un bébé souris transgénique.

Retirez le cervelet et disséquez le cerveau. Séparez le tissu cortico-hippocampique contenant les neurones excitateurs exprimant des protéines fluorescentes.

Transférez le tissu dans une plaque de culture contenant un tampon.

Émincez le tissu et transférez-le dans un tube contenant de la papaïne.

La papaïne digère la matrice extracellulaire du tissu, relâchant les cellules, y compris les neurones.

Transférez le tissu digéré dans un tube contenant des protéines BSA, arrêtant ainsi l’activité enzymatique et prévenant les dommages cellulaires.

Dissocier mécaniquement les tissus, libérant des cellules.

Centrifugez et retirez le surnageant contenant les débris et les enzymes.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu neuronal à faible fluorescence et filtrez-les à travers une passoire cellulaire, en éliminant les agrégats cellulaires.

Effectuez un tri cellulaire activé par fluorescence pour identifier et trier les neurones fluorescents.

Transférez les neurones triés dans un tube de microcentrifugation et centrifugez. Réactiver les neurones dans les milieux neuronaux.

Neurones-graines sur des lamelles enrobées de poly-L-lysine dans une plaque multi-puits. Les neurones adhèrent aux surfaces revêtues.

Ajoutez des milieux neuronaux. Incuber pour faciliter la croissance neuronale.

Tout d’abord, disséquez le cervelet et séparez les deux hémisphères. Ensuite, séparez soigneusement l’hippocampe et le cortex de chaque hémisphère. Transférez le tissu disséqué dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un tampon de culture cellulaire réfrigéré.

Ensuite, transférez l’hippocampe et le cortex disséqués dans le couvercle d’une autre boîte de Pétri de 35 millimètres. À l’aide du bord plat d’une lame de scalpel, hachez soigneusement le tissu dans un mouvement entrecroisé jusqu’à ce qu’il ne reste que de petits morceaux.

Ensuite, transférez le tissu haché avec une petite quantité de solution de papaïne du couvercle de la boîte de Pétri dans le tube stérile de papaïne. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes. Après l’incubation de la papaïne, transférez le tube stérile de papaïne et les tubes BSA stériles dans l’armoire d’écoulement. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur de 1 millilitre, transférez uniquement le tissu cortico-hippocampique du tube de papaïne dans le tube BSA 1.

Afin de briser les gros amas de tissu, triturez le tissu plusieurs fois à l’aide d’une pipette Pasteur de 1 millilitre. Ensuite, triturez le tissu sept fois à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine. Après 30 secondes, transférez 1 millilitre de la solution inférieure et du tissu du tube BSA 1 au tube BSA 2.

Triturez plusieurs fois le tissu dans le tube BSA 2 à l’aide d’une pipette Pasteur à pointe fine. Après la trituration, transférez 1 millilitre de tissu inférieur en solution du tube BSA 1 au tube BSA 3. Triturez le tissu dans le tube BSA 3 plusieurs fois.

Après la trituration, transférez toute la solution et les tissus des tubes 2 et 3 dans le tube BSA 1. Triturer 2 à 3 fois de plus et centrifuger à 3 000 fois g pendant 3 minutes. Après la centrifugation, retirer soigneusement le surnageant du tissu granulé et remettre les cellules en suspension à l’aide d’une pipette P1000 dans 2 millilitres de milieu complet Hibernate A à faible fluorescence. Ensuite, triturez le tissu 20 fois pour assurer une remise en suspension complète de la solution tissulaire.

Ensuite, filtrez la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules de 30 micromètres dans un tube d’échantillon en polystyrène. Préparez les tubes de collecte de tri cellulaire en pipetant 300 microlitres de milieu Hibernate A complet sur le nombre requis de tubes en polypropylène.

Pour chaque type de cellule fluorescente à trier, choisissez les filtres d’excitation et d’émission appropriés. Excitez les protéines veineuses à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et détectez la lumière émise à travers un ensemble de filtres d’émission 530 sur 40.

Excitez la protéine TdTomato en utilisant une longueur d’onde d’excitation de 531 nanomètres et détectez la lumière émise grâce à un ensemble de filtres d’émission 575 sur 30. Pour une grande pureté, triez les cellules fluorescentes marquées de couleurs vives. Après le tri des cellules, transférez les cellules collectées dans des tubes à centrifuger à fond rond de 2 millilitres. Ensuite, centrifugez les cellules à 3 000 fois g pendant 3 minutes pour former une pastille cellulaire.

Remettez en suspension la pastille cellulaire dans la quantité requise de milieu NBA complet préchauffé pour atteindre une densité cellulaire de 1 000 cellules par microlitre. Pour confirmer la présence de cellules dissociées, vérifiez la solution cellulaire au microscope à l’aide d’une lentille d’objectif 4x ou 10x. Avant de plaquer les cellules, agitez à vitesse moyenne pendant 2 à 3 secondes pour assurer une suspension uniforme des cellules.

Après le vortex, pipetez rapidement 10 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque lamelle. Au bout d’une heure, nourrissez les cellules avec 500 microlitres de milieu NBA complet préchauffé et retournez-les dans l’incubateur à 37 degrés Celsius.