JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 2:51 min • July 8th, 2025
Commencez avec une plaque multipuits contenant un insert poreux qui maintient un échafaudage en polystyrène possédant une structure poreuse tridimensionnelle.
Ajoutez de l’éthanol pour réhydrater l’échafaudage et lavez-le avec le fluide.
Introduire un milieu contenant une protéine de matrice extracellulaire, la laminine. Incuber pour permettre à la laminine de recouvrir l’échafaudage.
Ensemencez les cellules souches neurales humaines dans un milieu neural contenant des facteurs de croissance sur l’échafaudage recouvert de laminine.
Incuber pour permettre la migration des cellules souches dans l’échafaudage poreux où la laminine favorise l’adhérence cellulaire à l’échafaudage.
Les cellules utilisent les facteurs de croissance et prolifèrent dans cet échafaudage.
Ajoutez un milieu neural sans facteur de croissance et remplacez régulièrement le milieu épuisé pour maintenir la viabilité cellulaire.
L’absence de facteurs de croissance stimule la différenciation des cellules souches en cellules progénitrices neurales.
Au fil du temps, les processus neuronaux de ces cellules progénitrices s’allongent, permettant une croissance cellulaire multidirectionnelle et formant une culture tridimensionnelle.
Réhydratez les échafaudages en ajoutant à chaque puits de la plaque Alvetex à 12 puits, 2 millilitres d’éthanol à 70 %, préparés à l’aide d’eau pour l’irrigation. Évitez de toucher les échafaudages en distribuant l’éthanol à 70 % le long de la paroi de chaque puits. Aspirez soigneusement l’éthanol à 70 % et lavez immédiatement les échafaudages avec 2 millilitres par puits de DMEM F12 pendant une minute.
Répétez la procédure de lavage deux fois. Aspirez soigneusement le DMEM F12 après le lavage final. Enduisez les échafaudages en ajoutant 2 millilitres de laminine dans du DMEM F12 dans chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins deux heures.
Ensuite, lavez la plaque avec du DMEM F12 chaud. Ensemencez chaque échafaudage avec environ 500 000 cellules souches neurales humaines ou HNSC dans un volume de 150 microlitres de milieu RMM avec des facteurs de croissance. Incuber la plaque pendant trois heures pour permettre aux cellules de s’installer dans les échafaudages.
Après trois heures, ajoutez 3,5 millilitres de RMM dans chaque puits, en prenant soin de ne pas déloger les cellules des échafaudages. Incuber l’assiette pendant sept ou 21 jours. Remplacez le milieu après une journée, qui est la première tétée, et remplacez à nouveau le milieu 2 à 3 jours après la première tétée.