Génération de neurones sympathiques postganglionnaires à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Prenez une microplaque recouverte d’une matrice extracellulaire et ajoutez-y des cellules souches pluripotentes humaines en suspension dans un milieu de différenciation.

Le milieu contient des molécules de signalisation qui influencent les voies de signalisation cellulaires, dirigeant la différenciation en cellules progénitrices neurales.

Introduire un autre milieu de différenciation contenant des molécules de signalisation qui induisent la différenciation en cellules de crête neurale, ou NCC, précurseurs des cellules neuronales et non neuronales.

Ajoutez des enzymes pour perturber la matrice, dissociant ainsi les cellules.

Laver pour neutraliser les enzymes, puis centrifuger et jeter le surnageant. Remettre les CNC en suspension dans un milieu sphéroïde et les transférer sur une microplaque.

Les facteurs de croissance et les petites molécules du milieu induisent la formation de sphéroïdes.

Complétez avec de l’acide rétinoïque, qui favorise la différenciation en neurones progéniteurs sympathiques.

Transférez le sphéroïde sur une microplaque enrobée de protéine d’adhésion dans un milieu de maturation de neurones sympathiques, provoquant la fixation du sphéroïde.

Les facteurs de croissance neurale et l’acide rétinoïque dans le milieu favorisent la maturation en neurones sympathiques postganglionnaires, qui font partie du système nerveux périphérique et régulent les processus involontaires.

Un jour avant l’induction de la différenciation, enduire le nombre approprié de plaques à six puits avec deux millilitres de matrice de membrane basale par puits et stocker les plaques à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, réchauffez les plaques à température ambiante et lavez la culture de cellules souches pluripotentes humaines prête à être divisée deux fois avec du PBS frais par lavage.

Après le deuxième lavage, traitez les cellules avec sept millilitres d’EDTA de 0,5 millimolaire pendant 15 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, avant d’aspirer les cellules souches pluripotentes humaines flottantes et de transférer les cellules récoltées dans un tube de 50 millilitres.

Ajoutez un volume égal de PBS dans le tube pour diluer l’EDTA, et collectez les cellules par centrifugation. Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu de différenciation du jour 01. Avant d’ajouter un volume approprié de milieu pour le comptage, diluez les cellules à une concentration de 1,25 x 10⁵ cellules par centimètre carré dans deux millilitres de milieu de différenciation par puits.

Aspirer toute la solution de matrice de membrane basale de chaque puits de la plaque à six puits préalablement préparée. Ensuite, ensemencez 2 millilitres de cellules dans chaque puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, nourrissez les cellules avec 3 millilitres de milieu de différenciation du jour 01 par puits.

Le deuxième jour de la différenciation, nourrissez les cellules avec trois millilitres de milieu de différenciation du deuxième jour à dix par puits. Ensuite, nourrissez les cellules tous les deux jours jusqu’au 10e jour. Pour agréger les cellules de la crête neurale en sphéroïdes, le 10e jour, lavez les cellules avec du PBS et ajoutez deux millilitres de milieu de dissociation dans chaque puits. Après 20 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, transférez les cellules flottantes dans un tube conique de 50 millilitres et portez le volume de suspension dans le tube à 50 millilitres avec du PBS frais.

Recueillir les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un volume suffisant de milieu sphéroïde du jour 10 à 14 pour le comptage. Après le comptage, diluez les cellules à une concentration de 5 x 10⁵ cellules par 500 microlitres en utilisant un milieu sphéroïde du jour 10 à 14, et placez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une plaque à 24 puits à très faible attachement. Ensuite, retournez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour induire une culture minimale de sphéroïdes, le 11e jour de la culture, nourrissez les sphéroïdes de la crête neurale avec 500 microlitres supplémentaires de milieu sphéroïde du jour 10 à 14 par puits. Le jour 12, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes d’un côté de la plaque et aspirez soigneusement autant de milieu que possible de chaque puits sans aspirer de sphéroïdes. Ensuite, nourrissez les sphéroïdes avec un millilitre de milieu sphéroïde du jour 10 à 14 par puits.

Pour induire une culture de sphéroïdes élargie le 15e jour, nourrissez les sphéroïdes avec 1,5 millilitres de milieu sphéroïde des jours 10 à 14 complété par 0,5 micromolaire d’acide rétinoïque par puits. Ensuite, remettez les sphéroïdes dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour la différenciation des neurones sympathiques au jour 14 ou 28, inclinez la plaque pour accumuler les sphéroïdes d’un côté de la plaque et aspirez soigneusement autant de milieu que possible. Nourrissez les cellules avec un millilitre de milieu neuronal sympathique.

Pour briser de gros agrégats de sphéroïdes en sphéroïdes plus petits, n’ajoutez pas plus d’un millilitre de milieu par puits et pipetez les sphéroïdes cinq à 10 fois avant de les séparer.

Et retirez l’excès de laminine fibronectine des plaques à 24 puits préalablement préparées. Divisez la plaque d’un millilitre de sphéroïdes de chaque puits sur la plaque de culture de sphéroïdes à 24 puits entre quatre puits distincts de la plaque à 24 puits nouvellement revêtue. Ajoutez 250 microlitres de milieu neuronal sympathique frais dans chaque puits et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, remplacez le milieu dans chaque puits par un millilitre de milieu de neurones sympathiques complété par 0,125 micromolaire d’acide rétinoïque, et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire. Après le 35e jour, nourrissez les neurones en remplaçant soigneusement seulement la moitié du milieu existant dans chaque puits par un milieu frais.