Technique de co-culture pour différencier des cellules progénitrices neurales humaines en neurones

Prenez une culture de cellules progénitrices neurales humaines, ou NPC, soutenues par une matrice extracellulaire.

Les NPC sont conçus pour exprimer une protéine fluorescente.

Jetez le milieu et lavez les cellules pour éliminer tout milieu résiduel.

Incuber la culture avec des enzymes qui perturbent la matrice, dissociant les cellules.

Transférez les cellules détachées dans un tube et ajoutez un milieu pour neutraliser l’action enzymatique.

Centrifuger pour granuler les cellules, éliminer le surnageant et remettre en suspension les NPC dans un milieu de différenciation neuronale.

Transférez les NPC sur une co-culture établie d’astrocytes de souris et de neurones corticaux de rat.

Les facteurs de croissance libérés par la co-culture établie, ainsi que les contacts cellule-cellule des NPC avec les neurones corticaux et les astrocytes, favorisent la différenciation des NPC en neurones matures.

Les neurones matures présentent des processus cellulaires étendus et forment des connexions synaptiques.

Sous un microscope confocal, utilisez le signal des protéines fluorescentes pour visualiser les neurones humains dérivés de NPC.

Après avoir généré des cellules souches pluripotentes induites ou iPSC, induisez et maintenez les cellules en tant que cellule progénitrice neurale humaine ou culture NPC selon le protocole de texte. Dans cet exemple, les NPC sont marqués à l’aide du vecteur lentiviral Synapsin1-tdTomato. Le lendemain de l’ajout de neurones primaires à une culture d’astrocytes, utilisez 1X PBS pour laver une fois les PNJ humains. Ensuite, ajoutez la solution de détachement cellulaire et incubez pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Assurez-vous que toutes les cellules se sont détachées, puis transférez-les dans un tube de 15 millilitres contenant deux fois la quantité de DMEM/F12 et centrifugez à 200 g pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et utilisez un milieu de différenciation neuronale pour remettre doucement la pastille en suspension dans des cellules uniques. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.

Ensuite, aspirez soigneusement le milieu des cultures de neurones corticaux des astrocytes. Plaquez les NPC humains à 5 000 cellules par centimètre carré par puits dans un milieu de différenciation neuronale. Incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂ et remplacer le milieu tous les deux ou trois jours pendant au moins 28 jours.

Pour confirmer si les iPSC humaines se comportent comme des neurones matures, utilisez un microscope confocal équipé d’une lentille d’immersion dans l’eau 60x. Trouver des cellules différenciées des iPSC humaines en visualisant tdTomato.