Une méthode in vitro pour générer des organoïdes cérébraux humains
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:33 min • July 8th, 2025
Commençons par une culture de neurosphères, des amas flottant librement de cellules progénitrices neuroépithéliales.
Transférez ces neurosphères sur une feuille d’encastrement.
Retirez le support. Ajoutez une goutte de matrice membranaire extracellulaire contenant des protéines et des facteurs de croissance à chaque neurosphère.
Incuber pour que la matrice se solidifie, en intégrant les neurosphères en son sein.
Maintenant, transférez les neurosphères intégrées dans la matrice à l’aide de milieux neurosphériques vers une plaque de culture contenant des milieux neurosphériques.
couver. La matrice membranaire extracellulaire et ses constituants facilitent la différenciation des cellules progénitrices neuroépithéliales en cellules neuroépithéliales qui prolifèrent et forment des lumières remplies de liquide.
Après l’incubation, transférez les neurosphères dans une fiole tournante contenant des organoïdes cérébraux préchauffés. Incuber avec agitation pour une meilleure diffusion de l’oxygène et des nutriments, favorisant la croissance cellulaire.
Les facteurs de croissance et les inhibiteurs de petites molécules dans les milieux favorisent la différenciation neuronale et se développent en cellules de régions cérébrales spécifiques, formant des organoïdes cérébraux matures.
Pour commencer cette procédure, collectez les neurosphères à l’aide d’une micropipette de 200 microlitres, à l’aide d’une pointe de 2 millimètres préalablement coupée avec des ciseaux stériles. Ensuite, placez les neurosphères à environ 5 millimètres les unes des autres sur un film de paraffine dans une parabole de 100 millimètres, et retirez soigneusement autant de milieu restant que possible. Ensuite, ajoutez une goutte de matrice EHS sur chaque neurosphère.
Incuber les gouttes de matrice EHS avec les neurosphères pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Après cela, lavez soigneusement les neurosphères du film de paraffine en les rinçant avec un milieu neurosphérique. Par la suite, incubez les neurosphères pendant les quatre prochains jours et ajoutez 2 millilitres de milieu neurosphérique frais le deuxième jour.
Dans cette procédure, ajoutez 100 millilitres de milieu organoïde cérébral dans chaque fiole tournante à travers ses bras latéraux et préchauffez le milieu dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, assurez-vous que les neurosphères sont toutes séparées. Si deux ou plusieurs sont reliés par une matrice EHS, séparez-les en coupant la matrice de connexion avec un scalpel.
Mettez en place un programme d’agitation à 25 RPM. Transférez soigneusement les neurosphères intégrées à la matrice EHS dans les flacons tournants contenant 100 millilitres de milieu organoïde. Ensuite, placez les flacons tournants sur une plate-forme d’agitation magnétique dans l’incubateur pendant 14 jours à 37 degrés Celsius. C’est le jour zéro de la culture d’organoïdes. Changez le milieu une fois par semaine en retirant la moitié du milieu et en ajoutant la même quantité de milieu frais.
Aperçu
Cet article décrit une méthode permettant de différencier des cellules progénitrices neuroépithéliales en organoïdes cérébraux matures à l'aide de neurosphères et d'une matrice extracellulaire. Le processus implique l'encapsulation des neurosphères dans une matrice, leur incubation, puis leur transfert dans un flacon agité pour favoriser une croissance améliorée.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Culture d'organoïdes
Contexte
- Les neurosphères sont des agrégats de cellules progénitrices neuroépithéliales.
- Les composants de la matrice extracellulaire sont essentiels à la différenciation cellulaire.
- Les organoïdes cérébraux imitent la structure et la fonction du tissu cérébral réel.
- Les flacons agitateurs améliorent la diffusion des nutriments et de l'oxygène pour la croissance cellulaire.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour créer des organoïdes cérébraux à partir de neurosphères.
- Étudier la différenciation des cellules progénitrices neuroépithéliales.
- Améliorer la croissance et la maturation des organoïdes cérébraux in vitro.
Méthodes utilisées
- Culture de neurosphères et transfert vers une feuille d'encapsulation.
- Utilisation d'une matrice membranaire extracellulaire pour l'encapsulation des neurosphères.
- Incubation dans des flacons agitateurs contenant un milieu pour organoïdes cérébraux.
- Changements réguliers du milieu pour favoriser la croissance et la différenciation.
Résultats principaux
- Les neurosphères se sont différenciées avec succès en cellules neuroépithéliales.
- Des lumières remplies de liquide se sont formées au sein des organoïdes.
- Une croissance améliorée a été observée avec agitation dans des flacons agitateurs.
- Des cellules de régions cérébrales spécifiques se sont développées à partir des cellules progénitrices.
Conclusions
- La méthode produit efficacement des organoïdes cérébraux matures.
- Les composants de la matrice extracellulaire sont essentiels à la différenciation.
- La culture en flacon agité améliore le développement des organoïdes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle dans l'industrie
Les organoïdes cérébraux humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites fournissent un système physiologiquement pertinent pour modéliser le développement neurologique précoce et les mécanismes des maladies. Cette méthode in vitro permet la validation de cibles et le criblage phénotypique dans un contexte cellulaire humain pertinent pour la maladie, soutenant ainsi la réduction des risques mécanistiques dans les voies de découverte. L'approche renforce la confiance prédictive pour les candidats thérapeutiques ciblant le système nerveux central en recréant une différenciation spécifique aux régions et une organisation de type tissulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans un modèle neurodéveloppemental humain présentant une différenciation régio-sélective.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle de cibles grâce à la formation observable de bourgeons neuroépithéliaux et au développement de lumière.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans l'engagement de la cible en modélisant les mécanismes pathogènes précoces dans un système pertinent pour la maladie.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des organoïdes standardisés et reproductibles avec une différenciation neuroépithéliale et une identité régionale quantifiables.
- Valeur opérationnelle : L'incorporation dans la matrice extracellulaire et la culture en flacon agité permet une préparation d'essais reproductible et compatible avec différentes plateformes.
- Préparation aux essais : Produit des organoïdes matures adaptés au criblage de composés et aux analyses phénotypiques en aval.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les modèles dérivés de cellules souches pluripotentes induites et la validation préclinique en formant des tissus structurés et fonctionnels de type cérébral.
- Modélisation des maladies : Permet l'étude des troubles neurodéveloppementaux précoces à l'aide de lignées spécifiques à un patient ou de lignées isogéniques.
- Progression adaptée au risque : Permet d'évaluer la modulation d'une cible dans un système humain complexe avant les tests in vivo.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant de la validation de cibles jusqu'à l'évaluation préclinique en passant par l'identification de composés d'initiation, offrant un pont pertinent pour l'humain entre les tests réductionnistes et les modèles in vivo.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques par la différenciation neuroépithéliale et le balisage régional.
- Écrans de sélection : Fournit des organoïdes prêts à l'essai, formés de manière standardisée et produisant des signaux mesurables de différenciation.
- Analytique : Permet une évaluation quantitative de l'efficacité de la différenciation, de la formation de la lumière et de l'expression des marqueurs régionaux.
- Recherche translationnelle : Relie la phase initiale de découverte au travail préclinique grâce à une architecture tissulaire et une complexité cellulaire pertinentes pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme modulaire et évolutive, utilisable de façon répétée pour de multiples cibles et indications.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Fournit une confiance prédictive grâce à une modélisation neurodéveloppementale pertinente pour l'humain et à la réduction des risques associés aux cibles.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité par le biais de protocoles standardisés d'encastrement, d'incubation et d'agitation.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon en réduisant l'incertitude biologique dans la validation des cibles du système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats en fonction des résultats phénotypiques obtenus dans un système proche du cerveau humain.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches pluripotentes induites (iPSC), en différenciation neuroépithéliale et en manipulation de tissus en 3D.
- Dépend de l'accès à des composants de la matrice extracellulaire (par exemple, EHS) et à des bioréacteurs à flacon agité.
- Exige des formulations standardisées de milieux et une préparation des neurosphères soumise à un contrôle qualité.
- Implique des ajustements à envisager pour l'adaptation à différentes lignées cellulaires et origines génétiques.
- Limité par la variabilité d'un lot à l'autre concernant la taille des organoïdes et l'efficacité de différenciation en l'absence de contrôles stricts du processus.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026