Différenciation induite par stimulation électrique des cellules souches neurales et progénitrices

Commencez avec une puce microfluidique MOE connectée à une alimentation électrique.

La puce contient des régions de culture enrobées de poly-L-lysine connectées à des orifices d’entrée et de sortie, ainsi que des électrodes Ag/AgCl montées pour les connexions électriques.

Placez la puce microfluidique sur un appareil de chauffage pour des conditions de croissance optimales.

Flux de cellules souches neurales et progénitrices ou NPC dans les régions de culture enrobées via les sorties.

Les cellules interagissent électrostatiquement avec la poly-L-lysine et adhèrent au dispositif microfluidique.

Ensuite, introduisez un milieu de croissance contenant des facteurs de croissance qui facilitent la prolifération des cellules adhérentes.

Appliquer un courant électrique via les électrodes Ag/AgCl pendant une durée plus longue avec une alimentation continue de fluide pour la viabilité de la cellule.

Le courant électrique excite et active les NPC, favorisant l’extension des processus neuronaux à partir des corps cellulaires.

De plus, la stimulation électrique déclenche diverses voies de signalisation intracellulaires.

Ces voies favorisent les NPC à se différencier spécifiquement en diverses cellules neurales, telles que les neurones, les astrocytes et les oligodendrocytes.

Pour commencer, dessinez des motifs pour des couches individuelles de PMMA et du ruban adhésif double face à l’aide d’un logiciel approprié. Allumez le traceur laser à dioxyde de carbone et connectez-le à un ordinateur personnel. Ouvrez le fichier de modèle de conception à l’aide du logiciel.

Placez les feuilles de PMMA ou le ruban adhésif double face sur la plate-forme du traceur laser. Ensuite, focalisez le laser sur la surface des feuilles de PMMA ou du ruban adhésif double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique. Sélectionnez le traceur laser comme imprimante. Ensuite, utilisez le traceur laser pour commencer l’ablation directe sur la feuille de PMMA ou le ruban adhésif double face.

Retirez le film protecteur des feuilles de PMMA et nettoyez la surface à l’azote gazeux. Pour coller ensemble plusieurs couches de feuilles de PMMA, empilez trois morceaux de feuilles de PMMA de 1 millimètre et collez-les sous une pression de 5 kilogrammes par centimètre carré dans une soudeuse thermique pendant 30 minutes à 110 degrés Celsius pour former l’ensemble de canal d’écoulement ou de stimulation électrique. Collez 12 pièces d’adaptateurs aux ouvertures individuelles de la première couche de l’assemblage de puces MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide.

Désinfectez les substrats en PMMA de 1 millimètre, le ruban adhésif double face et le PMMA de qualité optique de 3 millimètres à l’aide d’une irradiation ultraviolette pendant 30 minutes avant d’assembler la puce. Collez les substrats PMMA de 1 millimètre sur le PMMA de qualité optique de 3 millimètres avec le ruban adhésif double face pour terminer l’assemblage du PMMA. Collez le verre de protection nettoyé sur l’ensemble PMMA avec le ruban adhésif double face.

Scellez les ouvertures des adaptateurs de pont d’agar avec des bouchons blancs étanches à la main. Connectez le connecteur à fond plat à l’ensemble de puce MOE via les adaptateurs d’entrée et de sortie du support. Ensuite, connectez l’adaptateur cone-Luer aux robinets d’arrêt à trois voies. Ajouter 2 millilitres de solution PLL à 0,01 % à l’aide d’une seringue de 3 millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois voies de l’entrée du fluide et connecter une seringue vide de 3 millilitres au robinet d’arrêt à trois voies de la sortie du fluide.

Remplissez les régions de culture cellulaire avec la solution PLL et pompez lentement la solution d’enrobage d’avant en arrière. Fermez les deux robinets d’arrêt à trois voies pour sceller la solution à l’intérieur des régions de culture. Incuber la puce MOE à 37 degrés Celsius pendant la nuit dans un incubateur rempli d’une atmosphère de dioxyde de carbone à 5 %. Ouvrez les deux robinets d’arrêt à trois voies et évacuez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution d’enrobage d’avant en arrière dans le canal à l’aide des deux seringues.

Prélevez 3 millilitres de milieu complet dans une seringue de 3 millilitres qui se connecte au robinet d’arrêt à trois voies de l’entrée du fluide, et ajoutez-la pour remplacer la solution d’enrobage dans les régions de culture cellulaire. Remplacez le bouchon blanc étanche à la main par l’adaptateur Luer et injectez 3 % d’agarose chaude pour remplir l’adaptateur. Connectez la seringue Luer-lock à l’adaptateur Luer et injectez de l’agarose chaude à 3 % à travers la bonde en caoutchouc noir pour remplir la seringue Luer-lock. Attendez 10 à 20 minutes pour que l’agarose refroidisse et se solidifie.

Installez la puce MOE à ensemencement cellulaire sur le réchauffeur ITO transparent qui est fixé sur une platine programmable motorisée XYZ maintenue à 37 degrés Celsius. Infusez les mNPC en les pompant manuellement dans la puce MOE via la sortie du fluide. Ensuite, incubez la puce MOE enracinée dans les cellules sur le radiateur ITO pendant 4 heures.

Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes de la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonctions à un amplificateur pour produire des impulsions CC à ondes carrées.