Génération d’organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes induites

Prenez des colonies de cellules souches pluripotentes induites, ou iPSC, cultivées sur une matrice de support.

Ajouter une solution contenant des enzymes pour dissocier les colonies en cellules uniques.

Transférez les cellules dans un tube, centrifugez-les et jetez le surnageant.

Remettez les iPSC en suspension dans un milieu de croissance.

Transférez les cellules dans une microplaque contenant des fibres polymères biocompatibles.

Centrifugeuse pour agréger de force les iPSC, formant des corps embryoïdes, ou EB, sur l’échafaudage polymère.

Transition vers un milieu d’induction neurale qui favorise la prolifération et la différenciation des iPSC en cellules souches neurales, cellules progénitrices et neurones immatures.

Lors de l’incubation, les cellules s’auto-organisent.

Placez les corps embryoïdes sur une feuille alvéolée et ajoutez-y des gouttes contenant des protéines de la matrice extracellulaire.

Incuber pour solidifier la matrice, en intégrant les EB.

Transférez les EB dans une microplaque contenant un milieu de maintenance neurale. Couver.

Les EB subissent une prolifération cellulaire pour former des protubérances et des bourgeonnements et se différencier en neurones matures, formant des organoïdes cérébraux.

Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette et lavez une fois les cellules avec du DPBS. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de solution de détachement cellulaire, ou 0,5 millimolaire d’EDTA, pour dissocier les colonies, et incubez à 37 degrés Celsius pendant 3 à 5 minutes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de milieu E8 frais dans chaque puits et pipetez doucement pour détacher toutes les cellules.

Transférez l’ensemble de la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 millimètres et ajoutez 1 millilitre de milieu E8 frais. Ensuite, faites tourner les cellules à 290 g pendant 3 minutes à température ambiante.

Après avoir éliminé le surnageant, remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 millilitre de milieu E6, complété par un inhibiteur de ROCK à 50 micromolaires, et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Préparer une suspension cellulaire de la densité d’assise souhaitée dans un milieu E6, complétée par l’inhibiteur de ROCK. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 96 puits.

Ensuite, centrifugez la plaque à 290 g pendant 3 minutes à température ambiante pour forcer l’agrégation des cellules. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone pour la formation du corps embryoïde.

Après 24 heures d’incubation, transférez la plaque dans la hotte, et aspirez soigneusement 120 microlitres de milieu à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas aspirer le corps embryoïde en abaissant la pointe de la pipette trop loin dans le puits.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de milieu E6 frais, complété par 2 micromolaires XAV939 et les inhibiteurs de SMAD dans chaque puits. Transférez la plaque dans l’incubateur et remplacez le milieu tous les jours par de l’E6 fraîchement préparé, complété par les inhibiteurs.

Au septième jour de l’incubation, vérifiez si tous les corps embryoïdes ont atteint un diamètre de 550 à 600 micromètres et présentent un bord lisse et clair. À ce stade, ils sont prêts à être intégrés dans une matrice extracellulaire.

Pour encastrer les organoïdes, préparez des feuilles d’enrobage alvéolées en plaçant une feuille de film d’étanchéité thermoplastique de 4 pouces de long sur une boîte P200 vide. Ensuite, utilisez un tube conique de 15 millilitres ou un tube de microcentrifugation de 500 microlitres, et enfoncez doucement la feuille de film dans les trous pour faire 12, soit le nombre souhaité de fossettes.

Ensuite, vaporisez de l’éthanol à 70 % sur la feuille de film et laissez-la sécher à l’intérieur de la cagoule avec la lumière UV allumée pendant au moins 30 minutes. Pendant ce temps, décongelez une quantité suffisante de matrice de membrane basale sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’une pointe P200 à large alésage, transférez un corps embryoïde de la plaque à 96 puits à chaque fossette. Retirez autant de support que possible avec une pointe de pipette normale, mais ne laissez pas le corps embryoïde sécher.

Ensuite, avec un embout P200 pré-refroidi régulier, ajoutez environ 30 microlitres de matrice membranaire non diluée à chaque organoïde, en veillant à ce que le corps embryoïde soit aussi proche que possible du centre de la gouttelette.

Une fois que tous les corps embryoïdes sont intégrés dans la matrice, placez la feuille de film dans une boîte de Pétri stérile. Ensuite, incubez la boîte de Pétri à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de dioxyde de carbone pour permettre à la matrice membranaire de se solidifier.

Pour la différenciation des organoïdes, ajoutez 5 millilitres du milieu de différenciation préparé avec B27 sans vitamine A dans un puits d’une plaque à 6 puits à très faible attachement. Préchauffez l’assiette à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Une fois que la matrice membranaire s’est solidifiée, transférez les corps embryoïdes encastrés dans la plaque à 6 puits en repoussant les fossettes de l’arrière de la feuille de film. Si nécessaire, utilisez 1 millilitre de milieu du puits et pipetez-le sur la feuille pour détacher les gouttelettes de la feuille de film.