Isolement de la microglie du cortex d’un cerveau de souris adulte

Prenez un cortex cérébral de souris fraîchement récolté.

Coupez le tissu en petits fragments. Transférez-les dans un homogénéisateur réfrigéré contenant un tampon contenant des inhibiteurs de RNase et des DNases.

Homogénéiser le tissu de manière optimale pour libérer les cellules en suspension, en préservant sélectivement la microglie en raison de sa capacité à résister aux forces de cisaillement et à maintenir la viabilité de la membrane, tout en éliminant les neurones et autres cellules gliales.

De plus, les inhibiteurs de la RNase dégradent les RNases, tandis que les DNases dégradent tout ADN contaminant.

Passez la suspension cellulaire à travers une crépine cellulaire pour éliminer les débris tissulaires.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube. Centrifugez et retirez le surnageant contenant des enzymes. Remettez les cellules en suspension dans une mémoire tampon.

Ajouter des microbilles magnétiques anti-myéline. Ces microbilles ciblent la protéine de myéline, liant les débris de myéline et les oligodendrocytes.

Chargez le mélange cellule-bille dans une colonne d’appauvrissement comprenant une matrice avec des sphères ferromagnétiques.

Sous le champ magnétique appliqué, les débris de myéline et les oligodendrocytes liés aux microbilles sont retenus dans la colonne, tandis que les cellules microgliales passent à travers.

Lavez la colonne avec un tampon et récupérez le flux contenant la microglie.

Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir pour couper chaque région du cerveau en petits morceaux de moins de 1 millimètre cube. À l’aide d’une pipette de 1 millilitre dont l’extrémité est coupée, transférez les morceaux de tissu dans des homogénéisateurs Dounce pré-réfrigérés. Homogénéisez le tissu en tournant lentement le piston à l’intérieur et à l’extérieur de l’homogénéisateur Dounce pendant 6 à 10 coups complets jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de morceaux visibles. Ensuite, transférez les tissus dissociés dans des tubes de 50 millilitres à travers des passoires de 70 micromètres.

Rincez chaque homogénéisateur et piston Dounce avec un total de 6 millilitres de milieu froid A, puis transférez le rinçage dans un tube de 15 millilitres pour la centrifugation. Centrifugeuse en suspension monocellulaire à 400 fois g et à 4 degrés Celsius pendant 5 minutes avec une pause à 5 minutes.

Rincez une grande colonne d’épuisement et trois grandes colonnes de sélection dans un séparateur magnétique avec 3 millilitres de MCS. Lorsque la centrifugation des échantillons de tissus est terminée, pipeter et jeter le surnageant sans déranger la pastille. Remettre en suspension les cellules dans le tampon MCS qui contient un inhibiteur de RNase.

Ajoutez 100 microlitres de billes d’élimination de la myéline dans chaque tube contenant des cellules en suspension du cortex et du cervelet, et ajoutez 50 microlitres de billes d’élimination de la myéline dans chacun des tubes contenant des cellules en suspension de l’hippocampe et du striatum. Incuber les tubes sur de la glace pendant 10 minutes.

Après cela, ajoutez du MCS dans le tube contenant les cellules corticales pour porter son volume à 2 millilitres, et aux tubes restants pour porter chacun de leurs volumes jusqu’à 1 millilitre. Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçage, chargez 2 millilitres de cellules corticales sur la grande colonne d’épuisement et 1 millilitre de chaque autre suspension cellulaire sur de grandes colonnes de sélection séparées. Ensuite, lavez une fois la grande colonne d’épuisement avec 1 millilitre de tampon MCS, et lavez chaque grande colonne de sélection deux fois avec 1 millilitre de tampon MCS pour chaque lavage.