Une technique simple pour isoler et cultiver des astrocytes murins

Coupez un cortex de souris en petits morceaux et transférez-le dans un milieu de dissection froid contenant une solution saline tamponnée.

Ajouter des enzymes digestives pour dissocier la matrice extracellulaire.

Pour éliminer les enzymes résiduelles, laver avec le milieu de dissection à froid.

Remplacez ce milieu par un milieu d’enrichissement en astrocytes.

Ensuite, utilisez une pipette pour dissocier les morceaux de tissu.

Passer la suspension à travers une passoire pour éliminer les tissus non dissociés et obtenir des cellules uniques.

Transférez les cellules sur une plaque recouverte de polymère chargée positivement. Incuber en secouant.

Les astrocytes adhèrent fermement, tandis que les neurones faiblement liés, la microglie et les oligodendrocytes se détachent.

Le milieu d’enrichissement convertit les astrocytes matures en astrocytes polygonaux diviseurs.

Retirez les cellules détachées et lavez les astrocytes avec un tampon de phosphate.

Ajoutez des enzymes digestives pour détacher les astrocytes.

Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter l’activité enzymatique. Recueillez les astrocytes dans un tube et centrifugez.

Jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de maturation des astrocytes pour favoriser une structure astrocytaire mature typique en forme d’étoile.

Coupez tout tissu cortical à utiliser pour générer des astrocytes en morceaux ne dépassant pas 1 millimètre cube. Une fois que tous les morceaux de tissu sont recueillis, attendez qu’ils se déposent au fond du tube. Ensuite, aspirez autant de fluide que possible. Ensuite, ajoutez 2 à 3 millilitres de trypsine EDTA à 0,05 % et incubez les échantillons dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Ensuite, aspirez soigneusement la trypsine EDTA, en laissant des morceaux de tissu dans une quantité minimale de liquide au fond du tube. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de milieu de dissection prérefroidi pour éliminer la trypsine EDTA restante, et pipetez sur le côté du tube supérieur pour obtenir le mélange des morceaux de tissu. Ensuite, aspirez le milieu de dissection et laissez les morceaux de tissu dans le moins de liquide possible.

Répétez deux fois cette étape de lavage avec un fluide de dissection prérefroidi. Après la dernière étape de lavage, ajoutez 1 millilitre de DMEM PLUS à température ambiante et titrez le tissu en pipetant de haut en bas sans introduire de bulles.

Les astrocytes sont assez sensibles au pH, il est donc important d’éviter de produire des bulles car cela peut modifier le pH de la solution.

Ensuite, placez une crépine à cellules de 100 microns dans l’ouverture d’un tube de 50 millilitres et pré-mouillez le filtre avec 4,5 millilitres de DMEM PLUS prérefroidi. Pipetez 1 millilitre de suspension de tissu dissocié sur la crépine cellulaire et ajoutez 4,5 millilitres supplémentaires de DMEM PLUS prérefroidi pour laver les cellules à travers celle-ci. Le jour in vitro 7 après la dissection, placez les boîtes de 10 centimètres avec les cellules de DMEM PLUS sur un agitateur dans l’incubateur et secouez les boîtes à 110 tr/min pendant six heures.

20 à 30 minutes avant la fin de l’agitation de six heures, préchauffez 1X PBS, DMEM PLUS, NB+H et 0,25 % de trypsine EDTA à 37 degrés dans le bain-marie. Après six heures d’agitation, retirez les plats de culture de l’agitateur et remplacez immédiatement le milieu par 10 millilitres de 1X PBS préchauffé par plat. Par la suite, retirez le PBS et ajoutez 3 millilitres de trypsine EDTA préchauffée par plat.

Ensuite, incubez les échantillons pendant quatre minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de DMEM PLUS préchauffé à 3 millilitres de trypsine EDTA dans chaque plat. Pipetez les cellules hors de la boîte et collectez la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres. Après cela, centrifugez la suspension cellulaire à 3 220 fois g à 20 degrés Celsius pendant quatre minutes. Retirez ensuite le surnageant, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 millilitre de NB+H préchauffé.