Développement d’une coculture de neurones et de macrophages in vitro

Commencez avec des neurones ganglionnaires de la racine dorsale murine isolés dans un milieu de croissance.

Plantez-les sur une plaque multi-puits recouverte de polymère pour favoriser l’attachement neuronal.

Ensuite, prenez une souris euthanasiée disséquée et injectez du PBS glacé dans sa cavité péritonéale.

Massez doucement le péritoine pour déloger les macrophages de la paroi du péritoine.

Pressez la souris pour recueillir le liquide péritonéal et traitez-le avec un tampon de lyse pour lyser sélectivement les globules rouges, qui apparaissent comme des contaminants. Centrifugez et mettez les cellules en suspension dans un milieu de culture.

Transférez les macrophages dans un insert poreux positionné à l’intérieur du puits contenant les neurones en culture.

Cette co-culture permet aux neurones et aux macrophages d’être à proximité.

Traiter la co-culture avec db-cAMP et incuber pour faciliter son entrée dans les cellules. Cela active les neurones pour sécréter les molécules de signalisation.

Ces molécules de signalisation, ainsi que l’AMPdb-c, incitent les macrophages à adopter un phénotype pro-régénérateur et à sécréter des facteurs essentiels à la croissance neuronale.

Avant de mettre en place la culture, pré-enduire une plaque de 6 puits de poly-D-lysine et de laminine. Ensuite, incubez la plaque à 6 puits avec 0,01 poly-D-lysine à 37 degrés Celsius pendant deux heures ou à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Après cela, lavez la plaque deux fois avec de l’eau distillée.

Ensuite, incubez la plaque avec une solution de laminine à une concentration de 3 microgrammes par millilitre pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, lavez la plaque deux fois avec de l’eau distillée et séchez-la à température ambiante pendant au moins une heure.

Maintenant, incisez la peau recouvrant la colonne vertébrale d’une souris euthanasiée avec une lame chirurgicale et disséquez les muscles paravertébraux bilatéralement pour exposer les os vertébraux. Retirez méticuleusement les os vertébraux à l’aide d’une rondure chirurgicale à pointe étroite jusqu’à ce que les DRG soient complètement exposés.

Sous un microscope à dissection, retirez le DRG bilatéralement de S1 jusqu’au niveau C1 à l’aide de ciseaux d’iridectomie et d’une pince à pointe fine. Transférez le DRG dans un tube Eppendorf de 1,5 millilitre à l’aide d’une pointe de pipette bleue avec une extrémité coupée.

Ensuite, retirez le DMEM après un essorage rapide pendant plusieurs secondes à l’aide d’une mini-centrifugeuse. Ajoutez 1 millilitre de DMEM contenant 125 unités par millilitre de collagénase de type 11 et incubez le tube pendant 90 minutes avec une rotation douce à l’aide d’une torsion ou d’un agitateur à 37 degrés Celsius.

Ensuite, jetez le DMEM contenant de la collagénase et ajoutez 1 millilitre de DMEM frais. Transférez le DRG dans un tube conique de 15 millilitres à l’aide d’une pointe de pipette bleue avec une extrémité coupée. Ensuite, pipetez doucement de haut en bas, au moins 15 fois pour obtenir une suspension cellulaire homogène.

Centrifugez le tube à 239 g pendant trois minutes et jetez soigneusement le surnageant avec les débris flottants. Ajoutez 1 millilitre de milieu neurobasal complété par de la vitamine B27 et remettez en suspension la pastille cellulaire en pipetant doucement de haut en bas cinq à dix fois.

Ensuite, faites passer la suspension cellulaire à travers une crépine de cellule de 70 micromètres superposée sur un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, placez tous les neurones DRG collectés sur deux puits de la plaque à 6 puits.

Pour préparer les macrophages péritonéaux primaires d’une souris adulte, incisez délicatement la peau abdominale pour exposer le péritoine et évitez de couper le péritoine pour éviter les fuites de liquide de lavage.

Ensuite, percez le péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de calibre 22 et injectez 10 millilitres de PBS glacé dans la cavité péritonéale. Massez doucement le péritoine pendant une à deux minutes. Ensuite, retirez l’aiguille et pressez le PBS à travers le site de ponction de l’aiguille, et recueillez le liquide de lavage dans un tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, centrifugez le liquide de lavage à 239 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius pour granuler les composants cellulaires. Par la suite, remettez en suspension la pastille avec 3 millilitres de tampon de lyse des globules rouges pendant trois minutes à température ambiante.

Ensuite, centrifugez à nouveau la suspension cellulaire à 239 g pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius. Remettez en suspension les cellules granulées dans 1 millilitre de milieu neurobasal B27. Placez la moitié de tous les macrophages collectés sur un insert de culture cellulaire d’une surface efficace de 4,2 centimètres carrés, qui est placé au-dessus du puits de DRG dissocié.

Quatre heures après que les macrophages neuronaux aient été co-cultivés, ajoutez 2 microlitres de solution d’AMP cyclique db-100 micromolaires aux co-cultures de macrophages neuronaux. Après 24 heures, remplissez un puits vide avec 1 millilitre de milieu de culture de macrophages dans la même plaque à 6 puits.

Transférez l’insert de culture cellulaire dans la co-culture de macrophages neuronaux dans le puits vide avec le milieu de culture de macrophages.