JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:00 min • July 8th, 2025
Commencez par une chambre microfluidique recouverte de polymère avec des puits proximaux et distaux reliés par plusieurs microsillons.
Dans le puits proximal, placez les tissus embryonnaires de la moelle épinière de souris riches en motoneurones en développement.
Complétez bien cela avec un milieu nutritif. Incuber pour permettre la croissance des neurones et l’adhérence à la surface recouverte de polymère.
Plus tard, ajoutez un milieu nutritif sans facteur de croissance au puits proximal.
Dans les puits distals, ajoutez un volume plus élevé de milieu nutritif contenant des facteurs de croissance pour créer des différences de concentration et de volume.
Ces différences font que les axones, les projections neuronales les plus longues, se développent vers les puits distaux via les microsillons.
Ajoutez une solution de colorant fluorescent dans les deux puits.
Les molécules de colorant pénètrent dans les neurones et colorent les mitochondries et les organites acides aux deux extrémités.
Dans l’imagerie confocale en direct, les organites colorés par fluorescence se déplacent dans les deux sens entre les corps cellulaires neuronaux et les axones, confirmant le transport axonal dans les motoneurones.
Jetez tout le milieu du compartiment proximal du MFC. Prélevez un seul explant de moelle épinière à l’aide d’une pipette d’un volume total de quatre microlitres et injectez-le le plus près possible de la grotte. Aspirez tout excès de liquide du puits proximal par les sorties latérales. Répétez l’étape précédente deux fois de plus et assurez-vous que les explants sont intégrés dans le canal proximal. Lentement, ajoutez 150 microlitres de milieu SCEX dans le puits proximal.
Un jour après le placage, replacez le milieu SCEX dans le compartiment proximal et ajoutez du milieu SCEX riche au compartiment distal, en maintenant un gradient de volume d’au moins 15 microlitres par puits entre les puits distal et proximal. Après quatre à six jours, les axones devraient passer au compartiment distal et être prêts pour l’imagerie de transport axonal.
Pour étiqueter les mitochondries et les compartiments acides, préparez un milieu SCEX frais avec 100 nanomolaires Mitotracker deep red FM et 100 nanomolaires LysoTracker red, et ajoutez-le dans les chambres microfluidiques. Incuber les pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, puis laver trois fois avec un médium SCEX chaud. Procédez à l’imagerie en direct du transport axonal, en acquérant une série d’images en accéléré de 100 secondes à des intervalles de 3 secondes avec un total de 5 minutes par film.