Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:51 min • July 8th, 2025
Prenez un rat euthanasié.
Ouvrez l’abdomen, excisez la vessie et plongez-la dans un tampon.
Ouvrez la vessie et retirez la graisse et les débris de tissus adhérents.
Transférez la vessie dans un tube contenant un tampon, une centrifugeuse et retirez les débris.
Placez le tissu dans une solution contenant de la collagénase et hachez-le. Ajoutez plus de collagénase pour dégrader la matrice extracellulaire, relâchant les cellules.
Centrifugez et jetez le surnageant. Ajoutez de la trypsine pour perturber les jonctions cellule-cellule, libérant ainsi les cellules.
Ajoutez un produit de rinçage contenant des protéines pour inactiver la trypsine, puis centrifugez et retirez le surnageant.
Remettre les cellules en suspension dans le média, les filtrer pour éliminer les agrégats et obtenir une suspension unicellulaire.
Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans le milieu.
Plaquez les cellules sur des lamelles enrobées pour faciliter la fixation des cellules neuronales et gliales. Retirez les cellules non attachées.
Ajouter des milieux neuronaux contenant des facteurs de croissance pour favoriser la maturation cellulaire, établissant ainsi une culture neuronale et gliale primaire.
Commencez par placer les rats sur une serviette chirurgicale stérilisée et exposez l’abdomen. Utilisez des ciseaux et des pinces pour ouvrir la cavité abdominale et révéler la vessie. Utilisez une autre paire de ciseaux et de pinces pour soulever doucement la vessie et la couper du col de la vessie.
Ensuite, placez rapidement la vessie dans une solution de Krebs froide et stable à l’oxygène pour améliorer la survie cellulaire. Ajoutez la solution de Krebs dans trois plats en verre et trois béchers en verre et placez-les dans un bain de glace pour le pré-refroidissement. Numérotez les plats et les gobelets 1, 2 et 3 pour éviter toute confusion.
Dans un plat en verre 1, ouvrez la vessie avec des ciseaux ophtalmiques et dépliez-la avec une pince et un séparateur de noyau. Rincez la vessie dans le bécher en verre 1 et placez-la dans le plat en verre 2. Éliminez la graisse adhérente à la surface des tissus à l’aide de la pince et des ciseaux ophtalmiques. Ensuite, rincez la vessie dans le bécher 2 et placez-la dans le plat 3.
Grattez doucement la vessie à l’aide de la pince et du séparateur de noyau de la cuillère pour éliminer les attaches exogènes. Rincez la vessie dans un bécher en verre 3 et transférez-la dans un tube à centrifuger de 15 millilitres avec 14 millilitres de solution froide de Krebs. Centrifugez l’échantillon pendant 1 minute à 360 fois g et 4 degrés Celsius.
Transférez la vessie du tube de centrifugation dans un flacon de 2 millilitres contenant 1 millilitre de solution de digestion. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la vessie en petits morceaux. Mélangez la solution vésicale avec 9 millilitres de solution de digestion 1 dans une boîte de culture cellulaire stérile. Effectuez la première digestion dans un incubateur agitateur pendant 1 heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone à 200 tr/min. Après la première digestion, centrifugez la solution à 300 fois g et 4 degrés Celsius pendant 8 minutes.
Pendant ce temps, placez la solution de digestion 2 dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour le préchauffage. Après la centrifugation, retirez la majeure partie du surnageant qui contient la solution de digestion 1, en laissant un peu de surnageant pour éviter la perte de cellules.
Remettez les cellules en suspension dans la solution de digestion tiède 2 et secouez le mélange pendant la digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Une fois la digestion terminée, désactivez immédiatement la trypsine en ajoutant 10 millilitres de produit de rinçage à froid. Centrifugez les cellules à 360 fois g et 4 degrés Celsius pendant 8 minutes. Ensuite, retirez autant de surnageant que possible pour éliminer toute la trypsine.
Remettez doucement en suspension les sédiments avec 3 millilitres de milieux neuronaux, en veillant à ne pas générer de bulles d’air dans la solution. Filtrez la suspension à travers une crépine de 70 micromètres dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Prélever les cellules par centrifugation à 360 fois g à 4 degrés Celsius pendant 8 minutes. Ensuite, remettez doucement en suspension les pastilles cellulaires dans 1 millilitre de média neuronal A et ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 48 puits. Cellules de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.