Culture de neurones murins primaires compartimentée à l’aide de puces microfluidiques en plastique

Prenez une puce microfluidique en plastique comprenant des réservoirs et des compartiments somatiques, ainsi que des réservoirs et des compartiments axonaux, reliés par des microsillons.

Ajoutez une solution de pré-revêtement pour saturer les compartiments et les rainures, évitant ainsi le piégeage des bulles d’air.

Aspirez la solution en laissant les compartiments principaux remplis. Laver avec un tampon.

Enduire les puits d’un polymère synthétique qui facilite l’adhésion neuronale. Laver avec un tampon et ajouter un milieu de culture pour éviter que la puce ne sèche.

Pour ensemencer une suspension de neurones de l’hippocampe du rat, aspirez le média.

Chargez la suspension dans les réservoirs somatiques. Les neurones entrent et se fixent dans le compartiment somatique.

Ajouter des milieux de culture neuronale dans les puits et incuber. Les facteurs de croissance présents dans les milieux facilitent la croissance neuronale.

Peu à peu, les neurones étendent leurs axones, qui se développent dans le compartiment axonal à travers les microsillons.

L’étroitesse des sillons empêche l’entrée des corps cellulaires neuronaux, assurant la séparation physique des régions somatiques et axonales.

Pour commencer, placez une puce stérile à plusieurs compartiments dans une boîte de Pétri. Ajoutez 100 microlitres d’une solution de pré-enrobage dans le puits supérieur gauche de la puce et laissez-la s’écouler à travers le canal principal dans le puits adjacent. Ensuite, remplissez le puits inférieur gauche de la puce avec 100 microlitres de la solution de pré-enrobage.

Cette fois, attendez cinq minutes pour permettre à la solution de s’écouler à travers les microsillons. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de la solution de pré-enrobage dans le puits supérieur droit et laissez-la s’écouler à travers le canal principal dans le puits adjacent. Après 90 secondes, remplissez le puits inférieur droit avec 100 microlitres de solution de préenrobage et incubez la puce pendant 10 minutes.

Inclinez soigneusement la pointe de la pipette loin du canal principal et aspirez la solution de chaque puits. Ensuite, ajoutez immédiatement 150 microlitres de PBS dans le puits supérieur gauche et attendez 1,5 minute. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS dans le puits inférieur gauche et attendez cinq minutes pour permettre au liquide de s’écouler à travers les microsillons.

Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS dans les puits supérieur droit et inférieur droit dans cet ordre. Après 10 minutes, aspirez à nouveau le PBS et répétez les étapes de lavage une deuxième fois. Après le deuxième lavage, aspirez le PBS dans les puits comme précédemment en inclinant la pointe de la pipette loin de l’ouverture du canal.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de 0,5 mg par ml de solution de poly-D-lysine dans le puits supérieur gauche de la puce. Attendez 1 minute et demie, puis remplissez le puits inférieur gauche avec 100 microlitres de la solution de poly-D-lysine. Répétez ce processus sur la moitié droite de la puce. Fermez la boîte de Pétri, puis placez la puce dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Après l’incubation, rincez la puce deux fois avec du PBS comme décrit précédemment. Ensuite, aspirez le PBS de l’appareil. Ajoutez immédiatement 100 microlitres de milieu de culture cellulaire dans le puits supérieur gauche de la puce. Après 1 minute et demie, ajoutez le média dans le puits inférieur gauche.

Attendez cinq minutes pour permettre au fluide de s’écouler à travers les microsillons, puis répétez le processus de remplissage sur le côté droit de la puce. Préparez une suspension cellulaire de neurones de l’hippocampe de rat dissociés selon les protocoles établis. Retirez la majorité des supports dans chaque puits de la puce, mais laissez les canaux remplis.

Ensuite, chargez immédiatement 5 microlitres de suspension cellulaire dans le puits supérieur droit et 5 autres microlitres de suspension cellulaire dans le puits inférieur droit. Lors du chargement des cellules, dirigez la pointe de la pipette vers le canal principal. Après avoir chargé les cellules, transférez la puce sur une platine de microscope pour vous assurer que les neurones sont dans le canal principal.

Après avoir attendu 5 minutes que les cellules se fixent, ajoutez environ 150 microlitres de milieu de culture neuronal dans chacun des puits supérieur et inférieur droit. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de média dans chacun des puits supérieur et inférieur gauche. Couvrez la boîte de Pétri et placez la puce dans un plateau humidifié dans un incubateur à 5 % de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius.