Reprogrammation neuronale directe des astrocytes de souris en neurones

Commencez avec une plaque multi-puits contenant des astrocytes génétiquement modifiés. Ces cellules sont collées à une lamelle placée dans un milieu astrocytaire.

Ces cellules génétiquement modifiées expriment des facteurs de transformation qui forcent leur transition en neurones. Ce processus s’appelle la reprogrammation neuronale.

Prenez un milieu de différenciation neuronale contenant des molécules spécifiques et le supplément de B27. Ensemble, ces composants fournissent des nutriments essentiels et des facteurs de différenciation.

Remplacez le milieu astrocytaire par le milieu de différenciation neuronale.

Incuber les astrocytes pendant la durée requise.

Au cours de l’incubation, les facteurs de transformation exprimés par les astrocytes déclenchent une séquence d’événements moléculaires qui permettent la conversion d’un astrocyte en neurone.

Les neurones convertis ont des corps cellulaires plus petits et des processus allongés, similaires aux neurones typiques.

Préparez le milieu de différenciation neuronale en ajoutant un millilitre de supplément de B27 à 49 millilitres de milieu de culture de base. Après 24 à 48 heures, selon que les cellules ont été transduites ou transfectées, remplacez le milieu astrocytaire par un millilitre de milieu de différenciation neuronale par puits. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius avec 9 % de dioxyde de carbone.

Pour augmenter l’efficacité de la reprogrammation, complétez le milieu de différenciation neuronale avec de la forskoline et de la dorsomorphine jusqu’à une concentration finale de 30 micromolaires et une micromolaire respectivement en remplaçant le milieu astrocytaire par le milieu de différenciation. Lorsque vous choisissez de traiter des cellules avec de la forskoline et de la dorsomorphine, fournissez une deuxième dose de dorsomorphine deux jours après le traitement initial. Ajoutez ce deuxième traitement directement dans le milieu de culture.