Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:10 min • July 8th, 2025
Commencez par des embryons de poisson-zèbre au stade précoce du développement dans un milieu embryonnaire.
Retirez le chorion, la membrane protectrice qui entoure les embryons, et transférez les embryons dans une plaque de culture fraîche contenant du milieu.
Retirez la partie de la queue de l’embryon, puis séparez la tête et détachez doucement les yeux de la tête.
Les yeux contiennent la rétine, une fine couche de tissu qui abrite les cellules ganglionnaires de la rétine.
Transférez les yeux dans un tube contenant un milieu de culture cellulaire de poisson-zèbre.
Dissocier mécaniquement les yeux pour libérer les cellules ganglionnaires rétiniennes et former une suspension unicellulaire.
Prenez des lamelles placées dans une plaque de culture contenant des milieux d’élevage de poisson-zèbre.
Les lamelles sont recouvertes d’un polymère synthétique et d’une protéine d’adhésion.
Transférez les cellules au centre de la lamelle et incuberez.
Les cellules ganglionnaires de la rétine se fixent aux surfaces revêtues, et de plus, ces cellules développent de longues projections appelées axones.
Récupérez les embryons de poisson-zèbre de l’incubateur et immergez-les dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres contenant 70 % d’éthanol, pendant 5 à 10 secondes pour le stériliser. À l’aide d’une pipette de transfert, transférez les embryons dans la boîte E2 Media #1 contenant des milieux E2 stériles pour éliminer l’excès d’éthanol. Ensuite, transférez les embryons dans la boîte E2 Media #2 et retirez leurs chorions avec des pinces tranchantes. Enfin, transférez les embryons dans la boîte E2 Media #3 pour effectuer des dissections.
À l’aide d’une paire de pinces fines, positionnez et tenez les embryons en avant du jaune avec l’une des pinces, et retirez la queue en arrière du sac vitellin avec l’autre pince. Saisissez le cou avec une pince et retirez la tête pour exposer le cerveau et les yeux au média E2. Avec la pointe d’une pince fine, roulez doucement les yeux de la tête tout en maintenant le tissu crânien vers le bas avec la deuxième pince. Transférez quatre yeux dans l’un des tubes préalablement préparés contenant ZFCM+.
Triturez doucement de haut en bas avec la pipette P20 environ 45 fois pour dissocier les cellules. Transférez le ZFCM+ avec les cellules dissociées au centre des lamelles. Maintenez les cultures sur la paillasse à 22 degrés Celsius, sur un support en mousse de polystyrène pour absorber les vibrations. Le jour de l’imagerie, vérifiez les cellules au microscope pour valider la croissance des axones RGC.