Préparation de cultures en tranches flottantes à partir d’un cerveau humain adulte

Prenez un tissu cérébral humain immergé dans une solution de tranchage. Le pH biologique et les nutriments de la solution aident à maintenir la fonctionnalité des tissus.

Retirez la couche externe des méninges et coupez le tissu pour créer une surface plane.

Épongez l’excès de solution du tissu. Fixez le tissu coupé à un disque d’échantillon à l’aide d’un bloc d’agarose, en gardant le tissu en contact avec le bloc pour faciliter la section.

Placez le disque dans un bac tampon vibrante et recouvrez le mouchoir d’une solution de tranchage glacée.

À l’aide du vibratome, générez des tranches uniformes qui préservent l’architecture tissulaire.

Coupez l’excès de tissu, en assurant une proportion constante de matière grise et blanche.

Placez les tranches dans une plaque multipuits contenant un milieu de culture et incuberez.

Les tranches restent en suspension dans le milieu pour assurer un accès uniforme aux nutriments, une technique connue sous le nom de culture de tranches flottantes.

Reconstituez régulièrement la culture avec un milieu supplémenté en facteur de croissance neurale pour maintenir la viabilité des tissus.

Transférez l’échantillon dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage. À l’aide d’outils chirurgicaux fins, retirez soigneusement autant de méninges restantes que possible. Choisissez la meilleure orientation de l’échantillon pour produire des tranches avec les caractéristiques particulières du plan expérimental, et utilisez une lame de scalpel numéro 24 pour découper une surface plane afin d’être la base qui sera collée au disque de l’échantillon.

À l’aide d’une cuillère en plastique jetable et de pinceaux délicats, récupérez le fragment de la boîte de Pétri et séchez l’excès de solution avec du papier filtre. Ensuite, utilisez de la super colle pour fixer le tissu au bol d’échantillon de vibratome jusqu’à ce qu’il adhère fermement au plat et soit en contact avec le bloc d’agarose.

Placez le disque de l’échantillon de vibratome dans le plateau de tampon du vibratome. Verrouillez le porte-couteau en place avec la lame de rasoir fermement fixée. Ajoutez la solution de tranchage et assurez-vous qu’elle couvre à la fois l’échantillon et la lame. Ensuite, commencez à couper l’échantillon en tranches de 200 micromètres.

Transférez les tranches du plateau tampon dans une boîte de Pétri contenant une solution de tranchage et coupez les bords lâches et l’excès de matière blanche dans une proportion d’environ 70 % de cortex et 30 % de matière blanche. Dans une armoire à flux laminaire, ajoutez 600 microlitres de milieu de culture dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et incubez à 36 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant au moins 20 minutes avant de plaquer les tranches. Après cela, utilisez un pinceau pour plaquer une tranche dans chaque puits.

S’il y a des puits inutilisés dans la plaque, remplissez-les de 400 microlitres d’eau stérile. Incuber à 36 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Complétez 10 millilitres du milieu de culture préalablement préparé avec du facteur neurotrophique dérivé du cerveau à une concentration de 50 nanogrammes par millilitre.

Après 8 à 16 heures, retirez 333 microlitres de milieu conditionné de chaque puits et ajoutez 133 microlitres de milieu frais supplémenté en BDNF. Remplacez un tiers du milieu conditionné par un milieu frais supplémenté en BDNF toutes les 24 heures.