$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Commençons par un cerveau isolé. Immergez rapidement le cerveau dans un liquide céphalo-rachidien artificiel pré-refroidi ou aCSF pour interrompre les processus métaboliques.
L’aCSF contient du NMDG, un gros cation organique qui réduit les lésions et la mort des cellules neuronales.
L’aCSF contient également de l’HEPES, qui maintient le pH et la concentration en sel et prévient le gonflement et les dommages cellulaires.
Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri contenant un papier filtre.
Coupez le cerveau pour obtenir la région souhaitée.
Fixez le bloc cérébral dans le porte-échantillon à l’aide d’une colle appropriée et incrustez-le dans l’agarose.
Positionnez le porte-échantillon dans la trancheuse.
Remplissez le réservoir de la trancheuse avec l’aCSF pré-refroidi et aérez la solution pour assurer un apport optimal en oxygène.
Obtenez des sections du bloc cérébral.
Transférez les sections dans l’aCSF préchauffé pour redémarrer les processus métaboliques, permettant aux sections de récupérer.
Prélevez doucement le cerveau intact dans le bécher de NMDG-HEPES aCSF prérefroidi et laissez le cerveau refroidir uniformément pendant environ 1 minute. Maintenant, utilisez une grande spatule pour transférer le cerveau du bécher sur la boîte de Pétri, recouverte de papier filtre.
Coupez et montez le cerveau, en fonction de l’angle de tranchage préféré et de la région cérébrale d’intérêt souhaitée. Travaillez rapidement pour éviter une privation prolongée d’oxygène pendant la manipulation. Ensuite, fixez le bloc cérébral sur le porte-échantillon à l’aide de colle adhésive.
Rétractez la pièce intérieure du porte-échantillon pour retirer complètement le bloc cérébral à l’intérieur. Ensuite, versez l’agarose fondue directement dans le support jusqu’à ce que le bloc cérébral soit entièrement recouvert d’agarose. Ensuite, fixez le bloc de refroidissement de l’accessoire prérefroidi autour du porte-échantillon pendant 10 secondes jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifiée.
Insérez le porte-échantillon dans le réceptacle de la trancheuse et vérifiez le bon alignement. Ensuite, remplissez le réservoir avec le reste prérefroidi et oxygéné NMDG-HEPES aCSF du bécher de 250 millilitres et placez une pierre à bulles dans le réservoir pendant la durée du tranchage pour assurer une oxygénation adéquate.
Ensuite, ajustez le micromètre pour commencer à faire avancer l’échantillon de cerveau incrusté d’agarose. Démarrez le slicer et ajustez empiriquement la vitesse avancée et la fréquence d’oscillation au niveau souhaité. Continuez à avancer et à trancher le tissu par incréments de 300 micromètres jusqu’à ce que la région cérébrale d’intérêt soit complètement sectionnée. La durée totale de la procédure de tranchage doit être inférieure à 15 minutes.
Pour la récupération initiale des NMDG, une fois la procédure de sectionnement terminée, prélevez toutes les tranches à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique coupée et transférez-les dans une chambre de récupération à 34 degrés Celsius, remplie de 150 millilitres de NMDG-HEPES aCSF.
Le moment de l’étape de récupération de la tranche cérébrale aiguë est très important pour pouvoir trouver un équilibre entre la préservation morphologique et la récupération fonctionnelle des propriétés électrophysiologiques de chaque neurone.