Isolement et culture de cellules souches neurales adultes de la zone sous-calleuse de souris

Commençons avec un cerveau de souris sur une matrice cérébrale refroidie.

Obtenez des sections contenant la zone sous-calleuse ou SCZ. Transférez la section dans un tampon de phosphate froid.

À l’aide d’un microscope à dissection, découpez la partie SCZ.

Coupez la SCZ disséquée en petits morceaux.

Transférez ces morceaux dans un tampon de digestion. Incuber pour dissocier les cellules du tissu.

Centrifugez et jetez le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans un milieu approprié.

Transférez les cellules dans une plaque de culture et ajoutez des facteurs de croissance spécifiques.

Les cellules souches neurales adultes se divisent, formant des amas appelés neurosphères.

Une mauvaise distribution des nutriments dans les amas de cellules limite la croissance cellulaire.

Pour disperser les grappes, centrifugez et jetez le surnageant. Remettez les grappes en suspension dans un tampon de dissociation et incuberez.

Pipetez la solution de haut en bas pour générer des cellules uniques.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettre les cellules en suspension et les transférer dans un milieu adapté pour obtenir une monocouche.

Une fois disséqué, transférez le cerveau de la souris dans un tampon PBS froid et rincez-le deux fois pour éliminer l’excès de sang. Ensuite, placez le cerveau dans la matrice cérébrale sur de la glace et effectuez des coupes coronales pour obtenir des tranches d’un millimètre d’épaisseur. Par la suite, transférez les tranches cérébrales postérieures contenant des régions SCZ vers du PBS froid.

À l’aide d’un microscope à dissection à faible grossissement, microdissèquez la SCZ de la zone de la substance blanche du cortex et de l’hippocampe à l’aide d’une aiguille pliée de calibre 30. Ensuite, retirez les régions du cortex au-dessus de la SCZ et placez la SCZ disséquée dans du PBS froid dans une boîte de Pétri de 35 millimètres sur de la glace.

La région de la zone sous-calleuse peut être disséquée avec précision à partir de l’ensemble du tissu à l’aide d’une matrice cérébrale et d’une aiguille de calibre 30 pliée.

Ensuite, retirez le PBS, puis coupez immédiatement les tissus disséqués en petits morceaux. Remettez-les en suspension avec un millilitre de tampon de digestion. Ensuite, transférez l’échantillon dans un tube de 15 millilitres contenant deux millilitres de tampon de digestion. Ensuite, incubez-le pendant 30 minutes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius.

Dans cette étape, tapotez doucement le tube pour dissocier le tissu digéré, puis centrifugez le tube à 145 fois g pendant cinq minutes. Après cinq minutes, jetez le surnageant, remettez en suspension le tissu digéré avec un millilitre de préchauffé et deux millilitres de milieu pour éliminer le tampon de digestion, et pipetez doucement la solution de l’échantillon au maximum cinq fois.

Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon à 145 fois g pendant cinq minutes. Après avoir jeté le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans un millilitre de milieu N2. Placez un millilitre de milieu N2 dans une plaque à six puits non revêtue et ajoutez un millilitre de cellules suspendues pour obtenir un volume final de deux millilitres.

Ensuite, ajoutez 20 nanogrammes par millilitre d’EGF et 20 nanogrammes par millilitre de bFGF dans chaque puits. Secouez doucement le plat de culture à six puits à la main pour mélanger les facteurs de croissance ajoutés avec les cellules plaquées. Ensuite, conservez la plaque à six puits dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Ajoutez 20 nanogrammes par millilitre d’EGF et 20 nanogrammes par millilitre de bFGF dans chaque puits tous les jours pendant huit jours. Tous les trois jours, ajoutez 200 microlitres de milieu N2 pour maintenir environ deux millilitres de milieu. Voici une image des neurosphères après huit jours.

Dans cette procédure, rassemblez les neurosphères et transférez-les dans un nouveau tube conique de 15 millimètres. Centrifugez le tube à 145 fois g pendant cinq minutes. Par la suite, jetez le surnageant et remettez les neurosphères en suspension avec 0,5 millilitre de tampon de dissociation. Incuber-les avec 0,5 millilitre de tampon de dissociation pendant cinq minutes dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pour dissocier les neurosphères en cellules uniques.

Pipetez doucement la solution d’échantillon de haut en bas moins de cinq fois et centrifugez le tube à 145 fois g pendant cinq minutes. Par la suite, jetez le surnageant et remettez les neurosphères en suspension avec un millilitre de milieu N2. Après avoir enduit une plaque à six puits de laminine PLL, plaquez les cellules à 2,5 x 10⁵ cellules par millilitre avec deux millilitres de milieu N2 par puits. Maintenez les cellules souches neurales adultes SCZ avec un traitement quotidien des facteurs de croissance pendant cinq jours avant de les expulser.