Génération d’organoïdes cérébelleux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites à l’aide de bioréacteurs à usage unique

Implantez des cellules souches pluripotentes induites par l’homme, ou iPSC, dans un bioréacteur. Les iPSC sont remises en suspension dans un milieu contenant un inhibiteur de l’apoptose cellulaire.

Sous l’effet d’un champ magnétique, la roue verticale du bioréacteur tourne à une vitesse contrôlée, facilitant le contact entre cellules et la formation d’agrégats. Retirez la majeure partie du milieu et ajoutez-y un milieu frais sans l’inhibiteur.

Continuez la culture. Une fois que les agrégats ont atteint une taille optimale, laissez-les se déposer par gravité. Retirez le fluide.

Ajouter un milieu de différenciation contenant des facteurs de croissance, et cultiver avec une vitesse de roue de bioréacteur réduite. Les facteurs de croissance favorisent la différenciation neuronale au sein des agrégats.

Ensuite, ajoutez un milieu frais complété par des facteurs de croissance et des chimiokines qui induisent le développement de progéniteurs cérébelleux.

Progressivement, les progéniteurs cérébelleux s’organisent en couches distinctes au sein des agrégats, formant des organoïdes cérébelleux précoces.

Enfin, ajoutez un milieu neuronal contenant des facteurs neurotrophiques spécifiques.

Ces facteurs induisent la maturation des progéniteurs cérébelleux en neurones cérébelleux fonctionnels synaptiquement actifs, générant des organoïdes matures.

Le jour 1, le jour 0 étant le jour de l’ensemencement du bioréacteur, placez le bioréacteur et l’unité de base dans une hotte à flux stérile. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, prélevez un échantillon de 1 millilitre de suspension cellulaire. Plaquez la suspension cellulaire dans une plaque à 24 puits à fixation ultra-basse. Utilisez un microscope pour confirmer que des agrégats dérivés d’iPSC se sont formés. Si c’est le cas, capturez des images des agrégats à 40x ou 100x.

Poursuivre la culture des iPSC dans le bioréacteur jusqu’à ce que le diamètre moyen des agrégats soit de 100 micromètres. Ensuite, remplacez 80 % du milieu par du mTesR1 frais sans inhibiteur de ROCK. Lorsque les agrégats atteignent 200 à 250 micromètres de diamètre, laissez tous les organoïdes se déposer au fond du bioréacteur. Ensuite, remplacez tout le support usé par un support de différenciation gfCDM.

Placez l’unité de base et le bioréacteur dans l’incubateur et réduisez l’agitation à 25 tr/min.