Isolement de cellules immunitaires infiltrant la tumeur d’un cerveau murin

Prenez un cerveau de souris perfusé contenant une tumeur.

L’étape de perfusion élimine les cellules immunitaires circulantes mais conserve les cellules infiltrées dans la tumeur.

Isolez le tissu contenant la tumeur.

Maintenant, dissociez mécaniquement le tissu.

La force mécanique détend le tissu, libérant les cellules.

Transférez le tissu dissocié dans un tube.

Centrifugez et jetez le surnageant contenant les débris.

Remettre le tissu en suspension dans une solution de digestion contenant de la collagénase et de la DNase.

La collagénase dégrade la matrice extracellulaire, libérant les cellules. La DNase dégrade l’ADN contaminant.

Ajoutez un tampon pour arrêter l’activité enzymatique.

Filtrer la suspension pour éliminer les agrégats cellulaires et obtenir une suspension unicellulaire.

Centrifugez et jetez le surnageant.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu à gradient à haute densité. Maintenant, superposez avec un milieu de gradient de plus faible densité, formant un gradient de séparation avec une interface claire.

Centrifuger pour séparer les couches. Les cellules immunitaires se rassemblent à l’interface entre les milieux à gradient tandis que les débris cellulaires flottent au sommet.

Prélevez les cellules immunitaires pour une analyse plus approfondie.

Dans cette procédure, à l’aide d’une lame de rasoir propre à un seul tranchant, isolez la zone du cerveau contenant la tumeur en faisant une coupe sagittale au centre du cerveau pour couper en deux les deux hémisphères. Retournez l’hémisphère ipsilatéral du côté médial vers le bas et faites une coupe coronale au niveau du cervelet et une autre coupe au niveau du bulbe olfactif pour isoler le tissu cible contenant l’implant tumoral.

Ensuite, placez le tissu cible dans le broyeur de papier en verre étiqueté, contenant 1 millilitre de DPBS. Poussez le piston à fond vers le bas et tournez-le sept fois pour perturber le tissu. Après cela, soulevez le piston pour permettre au liquide de se déposer au fond du broyeur de tissus. Répétez cette étape trois fois. Cependant, ne tournez le piston que quatre fois au cours des deux prochaines répétitions et trois fois lors de la dernière répétition pour éviter de trop triturer le tissu cérébral.

Par la suite, appliquez trois volumes de 1 millilitre de DPBS glacé sur les côtés du piston pour rincer la matière cérébrale résiduelle dans le broyeur de tissus. Ensuite, remettez en suspension la matière cérébrale triturée en pipetant de haut en bas et placez-la dans un tube à centrifuger de 15 millilitres étiqueté sur de la glace. Rincez les côtés du broyeur de tissus DAPS avec 1 millilitre supplémentaire de DPBS glacé et ajoutez-le dans le même tube de centrifugation de 15 millilitres.

Conservez tous les tubes contenant de la matière cérébrale triturée sur de la glace, jusqu’à ce que tous les échantillons aient été traités. Ensuite, faites tourner la matière cérébrale triturée dans les tubes à centrifuger de 15 millilitres à 740 fois g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius. Ensuite, retirez le surnageant et remettez en suspension la matière cérébrale granulée dans 1 millilitre d’un mélange préalablement préparé d’enzymes digestives de collagénase et de DNase I.

Placez les tubes à centrifuger de 15 millilitres dans un support de tube à essai et placez le support dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis agitez doucement les échantillons deux fois pendant la période d’incubation en agitant les tubes pour faciliter la désagrégation des tissus.

Par la suite, ajoutez 6 millilitres de DPBS glacé dans chaque tube pour diluer les enzymes digestives. Pipetez vers le haut et vers le bas pour la remettre en suspension et filtrez le volume total à travers des filtres stériles en nylon de 70 microns dans de nouveaux tubes à centrifuger de 15 millilitres étiquetés sur de la glace.

Ensuite, faites tourner la suspension des cellules cérébrales à 740 fois g pendant 20 minutes à 4 degrés Celsius pour obtenir une pastille unicellulaire. Retirez les tubes de 15 millilitres de la centrifugeuse et placez-les sur de la glace. Ensuite, augmentez la température de la centrifugeuse à environ 21 degrés Celsius en prévision de l’étape suivante.

Ensuite, retirez complètement le surnageant cellulaire et remettez d’abord les granules en suspension dans 1 millilitre de milieu de centrifugation de 70 % de densité, à l’aide d’une micropipette P1000. Ensuite, ajoutez quatre millilitres supplémentaires de média de centrifugation à 70 % de densité dans chaque tube. Mettez les capuchons en place solidement et homogénéisez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube plusieurs fois.

Après cela, transférez les tubes à centrifuger de 15 millilitres, contenant des cellules cérébrales remises en suspension dans un milieu de centrifugation à 70 % de densité, de la glace à un tube à essai à température ambiante. Un à la fois, superposez soigneusement 2 millilitres de solution de média de centrifugation de densité 37 % sur les 5 millilitres de média de centrifugation de densité 70 % pour former une interface propre entre les deux couches de média de centrifugation de densité.

Ensuite, marquez la position de l’interface entre les deux couches à l’aide d’un marqueur à pointe fine afin qu’elle puisse être facilement identifiée après centrifugation lorsque la distinction devient moins apparente. Faites tourner les tubes de centrifugation de 15 millilitres à 740 fois g pendant 20 minutes à température ambiante sans interruption pour éviter de perturber l’interface entre les couches de milieu de centrifugation de densité.

Ensuite, récupérez les PBMC qui se sont accumulés à l’interface entre les deux couches de milieu de centrifugation de densité en introduisant une micropipette P200 dans le tube, en contournant soigneusement la couche lipidique. Une fois au niveau de la bande PBMC, extrayez lentement 200 microlitres de la surface de la couche de média de centrifugation de 70 % de densité et transférez-les dans un tube FACS en polypropylène étiqueté respectivement étiqueté sur de la glace. Répétez cette étape une fois pour atteindre un volume total de 400 microlitres par échantillon.