Etablissement d’une culture tridimensionnelle de cellules gliales dérivées du cerveau de rat

Prenez une microplaque avec une culture adhérente de cellules gliales dérivées d’un cerveau de rat. La culture contient des astrocytes, des microglies et des oligodendrocytes.

Retirez le milieu, incubez avec une solution enzymatique pour détacher les cellules, puis transférez-les dans un tube.

Centrifugez et retirez le surnageant avec des débris cellulaires. Remettez les cellules en suspension dans un milieu chaud.

Triturer à l’aide d’une seringue pour briser les amas cellulaires et filtrer à l’aide d’une passoire pour obtenir une suspension unicellulaire.

Ajoutez un biopolymère photoréticulable, des agents de réticulation et des composants de matrice extracellulaire.

Versez le mélange dans un moule fixé à une lamelle. Exposez le mélange à une lumière de haute intensité pour induire la réticulation, la formation d’un gel et l’encapsulation des cellules gliales.

Retirez le moule et placez les lamelles dans une microplaque. Ajoutez un milieu chaud et incubez le gel dans des conditions physiologiques.

Les cellules prolifèrent dans la matrice extracellulaire de soutien et créent un réseau cellulaire, établissant une culture tridimensionnelle de cellules gliales.

24 heures avant l’encapsulation cellulaire, aspirez le milieu des cultures primaires de deux semaines et ajoutez 1 millilitre de milieu frais dans chaque puits. Le jour de l’encapsulation des cellules, préparez 12,5 millilitres de trypsine diluée et 25 millilitres de milieu pour chaque plaque à 12 puits, et réchauffez à 37 degrés Celsius dans un bain-marie. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, ajoutez environ 1 millilitre de trypsine diluée dans chaque puits de la plaque à 12 puits.

Incuber pendant 20 à 30 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la couche cellulaire confluente se détache de la plaque. Après l’incubation, utilisez une pipette de 1 millilitre pour récupérer les cellules détachées, qui doivent apparaître comme un seul morceau flottant, et transférez-les dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres. Diluer avec un volume équivalent de fluide et centrifuger à 200 fois g pendant 2 minutes à température ambiante.

Après la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de milieu chaud. Triturez les cellules cinq fois avec la pipette, puis centrifugez à nouveau à 200 fois g pendant deux minutes. Après la rotation, décantez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de milieu chaud et transférez les cellules dans un tube de centrifugation conique de 50 millilitres.

Ensuite, à l’aide d’une seringue de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18, triturez la solution cellulaire trois fois et filtrez la suspension à travers un tamis cellulaire de 40 microns dans un nouveau tube de centrifugation conique. Ensuite, prélevez 10 microlitres de suspension cellulaire, diluez 1 à 100 dans un milieu chaud, puis comptez les cellules avec un compteur de cellules automatisé.

Incuber les cellules restantes dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu’à l’étape d’encapsulation. Chauffez 12,5 millilitres de milieu naïf et 12,5 millilitres de milieu conditionné pour chaque plante : une plaque de 12 puits d’hydrogels 3D. Ensuite, pesez 7 milligrammes de HAMA par plante sur une plaque à 12 puits et ajoutez-la à un filtre stérile pour une concentration de 2 % en poids par volume. Sonicez la solution pendant 60 minutes à 20 kilohertz jusqu’à ce que le HAMA soit complètement dissous.

Pendant la soniation, préparez des solutions individuelles à 10 % de TEA et de NVP. Préparez également une solution de 1 millimolaire d’éosine dans des aliquotes de 1 millilitre de PBS stérile. Ensuite, pour chaque plaque à 12 puits, préparez un mélange final de 1,4 1,4 millilitre de 1 x 10 7 cellules, 0,5 % de HAMA, 20 % de mélange de lames basales dans du PBS, 0,1 % de TEA, 0,1 % de NVP et 0,01 millimolaire d’éosine Y.

Après avoir délicatement mélangé la solution, utilisez une pipette munie d’un embout de 1 millilitre pour distribuer 100 microlitres dans chaque moule PDMS. Ensuite, exposez les échantillons à une lumière LED verte de haute intensité dans une boîte fermée pendant 5 minutes à température ambiante.

L’exposition de cinq minutes à la LED verte est essentielle pour former le gel 3D. La couleur rouge introduite par l’éosine Y deviendra transparente et indiquera la fin de la réaction.

Ensuite, ajoutez 1 millilitre de média chaud et conditionné dans chaque puits d’une plaque à 12 puits ; saisissez chaque lamelle entre le pouce et l’index et utilisez une pince à épiler incurvée pour décoller lentement le moule PDMS sans déplacer le gel. Placez le moule dans un puits avec un milieu conditionné.

L’élimination du moule est l’étape la plus difficile. Cela doit être fait avec le plus grand soin pour éviter de déloger le gel et de fracturer la lamelle. Cela peut demander de la pratique.

Une fois que tous les moules ont été transférés dans les puits de la plaque, ajoutez 1 millilitre supplémentaire de milieu chaud DMEM/F12 dans chaque puits. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant deux semaines avant l’imagerie.