Différenciation de cellules souches pluripotentes humaines non transgéniques et transgéniques en cellules progénitrices neurales

Prenez une plaque multi-puits recouverte d’une matrice extracellulaire, ou ECM.

Dans des puits séparés, introduisez des cellules souches pluripotentes humaines non transgéniques et transgéniques dans un milieu de culture.

Les hPSC transgéniques portent un transgène sous un promoteur inductible par un antibiotique. Le transgène code pour un facteur de transcription qui induit une différenciation neuronale.

Incuber pour faciliter l’adhésion cellulaire à l’ECM. Les petites molécules du milieu empêchent l’apoptose, favorisant la prolifération cellulaire.

Ajoutez une solution de détachement pour dissocier les cellules, ajoutez le milieu pour arrêter la dissociation, puis transférez-les sur une autre microplaque recouverte d’ECM pour permettre la prolifération cellulaire.

Introduire un milieu de différenciation neurale contenant de petites molécules sur les cellules non transgéniques et l’antibiotique inducteur sur les cellules transgéniques.

Les petites molécules induisent les cellules non transgéniques à se différencier en cellules progénitrices neurales ou NPC. Dans les cellules transgéniques, l’expression du facteur de transcription induite par les antibiotiques active les gènes nécessaires à la différenciation en NPC.

Maintenir les NPC en culture pour les applications en aval.

Pour la génération de progéniteurs neuronaux et de neurones non transgéniques, ou hNeurones, voir jour 14 progéniteurs neuronaux dérivés de hPSC dans des plaques à six puits recouvertes d’ECM avec 2 millilitres de milieu neural et Y27632 par puits.

Si vous travaillez avec des iNeurones inductibles par la doxycycline, ajoutez un milieu neural contenant de la doxycycline lorsque les cellules sont confluentes à environ 35 % pour induire la différenciation et activer l’expression des gènes. Après deux jours, nourrissez des lignées transgéniques et non transgéniques avec 2 millilitres de média neural par puits et par jour. Continuez jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à se soulever à 70 % de confluence.