Génération de sphères de co-culture 3D d’astrocytes et de neurones pour induire la formation de synapses

Prenez une plaque multipuits recouverte d’un tensioactif pour réduire la tension superficielle du puits.

Ajoutez le rapport souhaité d’astrocytes et de neurones dans un milieu de culture approprié.

Centrifuger pour décanter les cellules puis incuber.

La faible tension superficielle empêche les cellules de coller à la surface du puits, provoquant leur agrégation.

Les cellules adhèrent les unes aux autres par le biais de diverses interactions membranaires, y compris des molécules d’adhésion, formant une sphère de coculture 3D.

Récupérez les sphères et transférez-les dans un tube.

Laissez les sphères se déposer. Retirer le surnageant et ajouter du milieu de culture frais.

Transférez les sphères dans une fiole tournante contenant un milieu de croissance approprié et incubez en essorant constamment.

Dans la sphère, les neurones étendent les projections les unes vers les autres, formant une jonction appelée synapse, tandis que l’astrocyte s’étend vers la synapse, établissant une association étroite avec les neurones.

Ajoutez le rapport souhaité de hAstros dissociés et de hNeurones ou iNeurones dans un volume total de deux millilitres à chaque puits d’une microplaque. Centrifugez la plaque à 100 fois g pendant trois minutes et retournez dans l’incubateur pendant deux jours.

Après une journée, des microsphères densément tassées devraient s’être formées dans la plaque. À l’aide d’une micropipette de 1 000 microlitres, retirez délicatement les sphères des micropuits. Appliquez légèrement une force sur le fond des micropuits avec un fluide pour enlever toute sphère collée supplémentaire.

Après avoir rassemblé toutes les sphères dans un tube conique de 15 millilitres, laissez-le se déposer. Ensuite, lavez les sphères en aspirant d’abord l’ancien milieu, puis en ajoutant au moins deux millilitres de milieu frais. Ajouter les sphères dans une fiole tournante contenant 50 à 60 millilitres de fluide. Placez le ballon dans l’incubateur sur une plaque d’agitation magnétique réglée à 60 tr/min. Un minimum de trois semaines en culture est nécessaire pour la formation des synapses.