Génération de cellules de type cellules de Schwann à partir de cellules stromales de moelle osseuse
JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 3:58 min • July 8th, 2025
Commencez par une culture adhérente de cellules stromales de la moelle osseuse.
Soumettez les cellules à l’hypoxie, une condition caractérisée par des niveaux d’oxygène réduits, pendant une durée requise.
Isolez les cellules préconditionnées à l’hypoxie, puis centrifugez et retirez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans des milieux progéniteurs neuronaux contenant des facteurs de croissance neuronale.
Transférez les cellules dans une plaque de culture à faible adhérence et incuberez.
Le préconditionnement de l’hypoxie et les facteurs de croissance neuronale induisent la différenciation des cellules stromales en progéniteurs neuronaux.
La surface de la plaque à faible fixation maintient les progéniteurs en suspension, facilitant leur prolifération et leur agrégation en neurosphères tridimensionnelles.
Récoltez les neurosphères, centrifugez et éliminez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans des milieux d’induction gliale contenant des facteurs de croissance spécifiques de la glie.
Transférez les neurosphères dans une plaque de culture recouverte de laminine, un composant de la matrice extracellulaire, et de poly-D-lysine, un polymère synthétique chargé positivement.
La surface enduite favorise l’adhésion cellulaire, facilitant l’attachement à la neurosphère.
Les facteurs de croissance spécifiques de la glie stimulent la différenciation des progéniteurs neuronaux en cellules semblables aux cellules de Schwann qui présentent la morphologie effilée caractéristique des cellules de Schwann.
Pour le préconditionnement hypoxique, d’abord, relâchez la bague de serrage et nettoyez les pièces exposées avec de l’éthanol à 70 %. De plus, démontez la chambre d’hypoxie en composants et placez-les dans une hotte à flux laminaire pour une stérilisation sous lumière UV pendant 15 minutes.
Ensuite, lavez une culture MSC confluente de 80 % à 90 % avec 10 millilitres de PBS, comme cela vient d’être démontré, et traitez les cultures avec un milieu de croissance MSC frais complété par 25 millimolaires d’HEPES. Placez la culture traitée dans la chambre d’hypoxie remontée et serrez la pince annulaire. Scellez les extrémités de raccordement de la chambre pour éviter toute fuite de gaz et rincez un mélange gazeux de 99 % d’azote et de 1 % d’oxygène dans la chambre à un débit de 10 litres par minute.
Après cinq minutes, placez la chambre dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 16 heures. Le lendemain matin, détachez les cellules comme nous venons de le démontrer, et collectez-les par centrifugation. Remettez la pastille en suspension dans un milieu progéniteur neural et ensemencez 6 x 103 cellules par centimètre carré sur des plaques à six puits à faible fixation pour leur culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 12 jours.
Des sphères non adhérentes de cellules importantes devraient être observées au jour 6 ou 7, avec plus de neurosphères apparentes dans les cultures conditionnées par l’hypoxie que celles sous normoxie aux jours 10 à 12. Le 12e jour, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les neurosphères dans un tube conique de 15 millilitres et collectez les neurosphères par centrifugation.
Remettez les sphères en suspension dans DMEM/F12 et plaquez 5 à 10 neurosphères par centimètre carré sur des plaques à six puits recouvertes de poly-D-Lysine laminine dans 1,5 millilitre de milieu d’induction gliale par puits. Maintenez la culture cellulaire sphérique pendant au moins sept jours, en rafraîchissant le milieu tous les trois jours.
Aperçu
Cette étude examine la différenciation de cellules stromales de la moelle osseuse en progéniteurs neuronaux et en cellules de type cellules de Schwann dans des conditions d'hypoxie. La méthodologie comprend une préconditionnement à l'hypoxie suivi d'une culture dans des milieux spécifiques afin de favoriser la croissance et la différenciation cellulaires.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules souches
Contexte
- Les cellules stromales de la moelle osseuse peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- On sait que l'hypoxie influence le comportement et la différenciation des cellules souches.
- Les facteurs de croissance neuronaux sont essentiels au développement des progéniteurs neuronaux.
- La culture de neurosphères en trois dimensions améliore la prolifération cellulaire.
Objectif de l'étude
- Étudier les effets de l'hypoxie sur la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse.
- Évaluer le potentiel de ces cellules à devenir des progéniteurs neuronaux et des cellules de type cellules de Schwann.
- Mettre en place une méthode fiable pour générer ces types cellulaires in vitro.
Méthodes utilisées
- Préconditionnement en hypoxie de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse.
- Isolation et resuspension des cellules dans un milieu pour progéniteurs neuronaux.
- Culture des cellules sur des plaques à faible adhérence pour former des neurosphères.
- Induction de la différenciation gliale à l’aide d’un milieu d’induction gliale sur des plaques revêtues.
Résultats principaux
- Les cellules préconditionnées à l'hypoxie ont montré une différenciation accrue en progéniteurs neuronaux.
- Les neurosphères se sont formées plus abondamment en conditions hypoxiques par rapport aux conditions normoxiques.
- Les cellules de type cellules de Schwann ont présenté une morphologie caractéristique après l'induction gliale.
- Des méthodes efficaces de culture et de différenciation des neurosphères ont été établies.
Conclusions
- L'hypoxie constitue une stratégie de conditionnement préalable bénéfique pour la différenciation des cellules souches.
- L'étude fournit un cadre permettant de générer des types cellulaires neuronaux et gliaux à partir de cellules stromales.
- Les applications futures pourraient inclure la médecine régénérative et la recherche en neurobiologie.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet la génération de cellules de type cellule de Schwann à partir de cellules stromales de la moelle osseuse, offrant ainsi une source échelonnée pour la modélisation des maladies du système nerveux périphérique et des applications en médecine régénérative. La préconditionnement en hypoxie améliore l'efficacité de la différenciation, soutenant la validation ciblée dans les modèles de douleur neuropathique et de lésion nerveuse. L'approche permet une détection mécanistique des risques en produisant des cellules gliales pertinentes pour la maladie, destinées au criblage préclinique et à la découverte de biomarqueurs.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des interactions glie-neurone dans les modèles de pathologie du nerf périphérique.
- Valeur opérationnelle : Fournit une source renouvelable de cellules de type cellules de Schwann pour les études d'engagement ciblé.
- Valeur prédictive : Permet la validation fonctionnelle des cibles impliquées dans les voies de démyélinisation et de remyélinisation.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des cellules gliales présentant une morphologie caractéristique, utiles pour le criblage fondé sur des tests de composés neuroprotecteurs.
- Valeur opérationnelle : La formation de neurosphères permet une production reproductible et évolutive de progéniteurs prêts à subir une différenciation.
- Préparation aux tests : L'adhérence à des surfaces revêtues de laminine et de poly-D-lysine permet un ensemencement standardisé pour les essais de réponse aux médicaments.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Les cellules de type cellule de Schwann modélisent la fonction gliale périphérique dans les modèles de lésions neuropathiques et de maladies démyéliniantes.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre l'origine des cellules stromales et les phénotypes gliaux pertinents pour les études de régénération des nerfs périphériques.
- Réduction prédictive des risques : Permet une évaluation précoce des effets des composés sur la différenciation gliale et le potentiel de myélinisation.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de découverte précoce en transformant des cellules souches mésenchymateuses accessibles en cellules de lignée gliale pour le criblage ciblé et des phénotypes en aval.
- Découverte en biologie : La préconditionnement à l'hypoxie améliore le rendement en progéniteurs, permettant une validation ciblée à grande échelle des voies gliales.
- Tri : La culture de neurosphères permet l'expansion et la conservation de progéniteurs en vue de la préparation de cellules prêtes à l'essai.
- Analytique : Les paramètres morphologiques et les marqueurs permettent de quantifier l'efficacité de la différenciation pour le criblage de composés.
- Recherche translationnelle : Les cellules de type cellules de Schwann produites permettent l'évaluation préclinique de stratégies de remyélinisation dans des modèles de nerfs périphériques.
- Réutilisation en entreprise : Le protocole peut être adapté à différents donneurs de CSM et à diverses conditions d'induction gliale, permettant une réutilisation de la plateforme dans la découverte de neurothérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit la dépendance aux cellules gliales primaires en fournissant une source alternative de cellules stromales différenciables.
- Valeur opérationnelle : Des conditions définies de milieu et d'ensemencement améliorent la reproductibilité entre laboratoires et sites.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions d'orientation (go/no-go) fondées sur la capacité de différenciation gliale et la modulation de cibles dans des cellules pertinentes pour la maladie.
- Impact sur le portefeuille : Soutient un investissement ajusté au risque dans les cibles du système nerveux périphérique grâce à des modèles cellulaires validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, manipulation de l'hypoxie et techniques de différenciation gliale.
- Dépend de l'infrastructure de chambre à hypoxie et de systèmes stériles de mélange de gaz pour la préconditionnement.
- Exige des protocoles standardisés d'ensemencement utilisant de la laminine et du poly-D-lysine pour une adhésion constante des neurosphères.
- L'adaptation à différentes sources de CSM peut nécessiter une optimisation de la durée d'hypoxie et des concentrations de facteurs de croissance.
- Limitée par la nécessité de délais prolongés de culture (12 jours ou plus) et d'une surveillance attentive de la formation et de la différenciation des neurosphères.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
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Dernière mise à jour : 29 août 2026