Isolement de neurones DRG et coculture avec des précurseurs de cellules de Schwann pour générer des cellules de Schwann

Prenez la moelle épinière d’un embryon de rat avec des ganglions de la racine dorsale attachés, ou DRG, contenant des neurones et des cellules gliales.

Détachez les DRG individuels du cordon, transférez-les dans un tube et centrifugez-les, en éliminant tous les débris de tissus.

Ajoutez des enzymes pour dissocier les neurones DRG et les cellules gliales.

Faites tourner les cellules et retirez tous les débris. Ajouter un milieu d’entretien neuronal et du triturrate pour générer une suspension unicellulaire.

Transférez la suspension dans une microplaque recouverte d’un substrat de culture, favorisant l’adhésion cellulaire.

Introduisez un milieu de purification et incuberez. Les agents inhibiteurs du milieu éliminent les cellules gliales en division tandis que les neurones non diviseurs survivent.

Prenez des cellules de type cellules de Schwann, ou SCLC, dans un milieu de co-culture. Les SCLC, précurseurs des cellules de Schwann, interagissent avec les neurones nerveux périphériques embryonnaires.

Introduisez la suspension dans les neurones DRG et incuber. L’interaction des SCLC avec les neurones DRG favorise leur maturation en cellules de Schwann.

Les cellules de Schwann générées sont prêtes à être analysées.

Pour récolter les ganglions de la racine dorsale, transférez le premier embryon dans une boîte de culture de 10 centimètres contenant du PBS à température ambiante sous un microscope à dissection en position couchée et insérez une pince de micro-dissection de chaque côté de la moelle épinière.

À l’aide d’une dissection émoussée, séparez la moelle épinière des tissus mous environnants, à l’aide d’une pince, pour exciser la moelle épinière le long de l’ouverture du cou et du bout de la queue. Retirez les tissus mous résiduels de la moelle épinière libérée jusqu’à ce qu’il ne reste que la moelle épinière, les racines nerveuses et le ganglion de la racine dorsale attaché.

Détachez les ganglions de la racine dorsale de leurs racines nerveuses de connexion. Ensuite, utilisez un stylo-pipette équipé d’une pointe de pipette de 1 millilitre pour transférer jusqu’à 100 ganglions de la racine dorsale dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre de PBS.

Recueillir les ganglions par centrifugation et remettre les pastilles en suspension dans 200 microlitres de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant par tube. Après 10 minutes à 37 degrés Celsius, centrifugez à nouveau les ganglions de la racine dorsale à l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour triturer doucement les granules dans le milieu de maintenance des neurones postganglionnaires de la racine dorsale.

Ensemencez les cellules ganglionnaires de la racine dorsale à 5 x 10³ cellules par centimètre carré sur des plaques à six puits recouvertes de laminine Poly-D-Lysine dans 1,5 millilitre de milieu de maintenance des neurones du ganglion de la racine dorsale par puits.

Après deux jours de culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂, lavez les cellules et renvoyez les cultures de cellules neuronales dans l’incubateur dans un milieu de purification de neurones du ganglion de la racine dorsale fraîche pendant deux jours supplémentaires.

Après 3 à 4 cycles d’entretien et de purification, les cultures de cellules ganglionnaires de la racine dorsale devraient être positives pour le marqueur neuronal Tuj-1 et négatives pour le marqueur des cellules gliales S100 bêta.

Au 7e jour de la culture cellulaire de type cellule de Schwann, rincez les cellules dans du PBS, suivi d’une dissociation avec 0,5 millilitre de réactif de dissociation cellulaire enzymatique recombinant par puits à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de co-culture et ensemencez les cellules de type cellule de Schwann sur la culture de neurones ganglionnaires de la racine dorsale purifiée à 1 x 10³ cellules par centimètre carré pendant 14 jours de co-culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO₂.