Replacage de neurones différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes humaines

Commencez avec une grande plaque de culture contenant des neurones différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes humaines avec un réseau neuronal dense.

Incuber ces neurones avec des enzymes protéolytiques douces pour les détacher de la plaque, en les soulevant comme une feuille.

Avec une incubation continue, les enzymes perturbent partiellement les connexions cellulaires, relâchant les réseaux neuronaux.

Ajouter un milieu de culture pour arrêter l’activité enzymatique.

Pipetez à plusieurs reprises les neurones détachés pour les séparer les uns des autres.

Filtrez les neurones à travers une passoire cellulaire pour éliminer les amas de cellules et collecter les neurones individuels.

Centrifugez et retirez le surnageant. Remettez-les en suspension dans un milieu de croissance.

Pour le replacage, ensemencez ces neurones sur un polymère et une plaque multipuits recouverte de protéines d’adhésion. Incuber pour permettre leur fixation.

Les neurones utilisent les nutriments du milieu pour rester viables. Remplacez régulièrement le milieu de culture pour maintenir les niveaux de nutriments.

Incuber davantage pour permettre la maturation neuronale et la formation de connexions entre eux.

Commencez par rincer doucement la plaque de neurones différenciés avec du PBS. Dispersez le PBS le long de la paroi de la plaque, et non directement sur les cellules pour éviter de les perturber. Aspirez le PBS du bord de la parabole tout en le basculant en prenant soin de ne pas toucher les cellules.

Appliquez au moins 1 millilitre d’enzyme protéolytique par plaque de 10 centimètres et remettez les cellules dans l’incubateur pendant 40 à 45 minutes. Pendant l’incubation, vérifiez les neurones sur un microscope à contraste de phase et continuez le traitement par protéase jusqu’à ce que le réseau neuronal se détache complètement de la plaque et commence à se désagréger. Lorsque les neurones se sont détachés, arrêtez la digestion en ajoutant 5 millilitres de DMEM frais pour 1 millilitre de protéase.

À l’aide d’une pipette sérologique, triturez doucement les cellules contre la plaque 5 à 8 fois, en veillant à ne pas appliquer trop de pression. Filtrez les cellules à travers une maille de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres goutte à goutte, et rincez la crépine avec 5 millilitres supplémentaires de média DMEM frais.

À l’aide d’une centrifugeuse de paillasse, faites tourner les cellules à 1 000 fois g pendant 5 minutes. Après la centrifugation, retournez le tube conique dans l’enceinte de biosécurité et aspirez la majeure partie du milieu, en laissant 250 microlitres pour garder les cellules humides. Remettez doucement les cellules en suspension dans 2 millilitres de milieu DMEM frais et passez-les à l’extrémité d’une pipette sérologique de 5 millilitres.

Enfin, retournez le tube 2 à trois fois. À l’aide d’un hémocytomètre et d’un bleu trypan, vous pouvez compter les cellules viables, puis diluer les cellules avec du DMEM frais à la concentration souhaitée. Ajoutez des suppléments appropriés dans le tube en fonction des exigences de la lignée cellulaire spécifique, et mélangez doucement les cellules en inclinant le tube conique 2 à 3 fois.

Aspirez le revêtement de laminine d’une plaque à 24 puits et rincez-le une fois avec du PBS. Aspirez le PBS et appliquez la solution cellulaire dans chaque puits dans un mouvement en huit pour éviter l’agglutination. Une fois le placage des cellules terminé, remettez la plaque dans l’incubateur réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.