Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 3:09 min • July 8th, 2025
Prenez une suspension de cellules souches embryonnaires de souris.
Centrifugez, retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de différenciation neurale.
Placez les gouttelettes de la suspension sur la face intérieure du couvercle d’une plaque de culture.
Ajoutez un tampon sur la plaque inférieure pour éviter que les gouttelettes ne sèchent. Placez le couvercle sur la plaque inférieure, formant une culture de gouttes suspendues, et incuberez.
En raison de la gravité, les cellules se regroupent et forment des agrégats tridimensionnels appelés corps embryoïdes ou EB.
Placez les gouttelettes dans une plaque contenant le milieu de différenciation et incubez sous agitation pour la croissance des EB.
Centrifuger et retirer le milieu, remettre en suspension les EB dans le milieu de différenciation complété par de l’acide rétinoïque, les transférer dans une plaque de culture et incuber.
L’acide rétinoïque pénètre dans les cellules et déclenche la formation d’un complexe de transcription. Le complexe induit l’expression des gènes, déclenchant la différenciation en cellules progénitrices neurales.
Les EB différenciés sont prêts pour les applications en aval.
Commencez par mettre en place la culture cellulaire en goutte suspendue. Pour une plaque de culture cellulaire de 10 centimètres, ajustez la concentration à 500 cellules par 20 microlitres de milieu de différenciation. Préparez suffisamment de suspension cellulaire pour 50 gouttelettes de 20 microlitres. À l’aide d’une micropipette ou d’une pipette à répéteur, placez des gouttelettes de 20 microlitres de suspension cellulaire sur le couvercle d’une plaque de culture tissulaire, en veillant à ce que les gouttelettes ne soient pas trop proches les unes des autres pour éviter qu’elles ne fusionnent.
Remplissez l’assiette de 5 à 10 millilitres de PBS et remettez délicatement le couvercle sur l’assiette. Incuber la culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius. Après deux jours, collectez les gouttelettes du couvercle et placez-les dans une plaque de suspension de culture cellulaire de 10 centimètres, remplie de 10 millilitres de milieu de différenciation. Ensuite, placez la plaque sur un agitateur orbital réglé à basse vitesse dans l’incubateur. Après deux jours supplémentaires, centrifugez les cellules à 200 fois g pendant trois minutes et retirez le surnageant.
Pour induire la différenciation du corps embryoïde en cellules progénitrices neurales, réintroduisez les cellules dans un milieu de différenciation avec de l’acide rétinoïque 5-micromolaire. Incuber l’assiette pendant deux jours. Ensuite, remplacez la moitié inférieure du milieu par un milieu frais en inclinant la plaque et en la pipetant.