Silençage génique médié par siRNA dans des cellules souches neurales

Prenez le petit ARN interférent, ou siRNA, un type d’ARN impliqué dans le silençage génique.

Ajoutez des vésicules lipidiques sphériques appelées liposomes.

Le liposome encapsule l’ARNi, le protégeant de la dégradation.

Ajoutez des complexes siARN-liposomes à une culture contenant des cellules souches neurales. Gardez-en un bien comme contrôle, et incubez.

Le liposome fusionne avec la membrane cellulaire, libérant l’ARNi.

Le siRNA se lie au complexe de silençage induit par l’ARN, ou RISC, où un brin est retiré.

Le brin restant cible l’ARNm responsable de la différenciation cellulaire, conduisant à sa dégradation.

Ajouter un milieu de différenciation approprié aux puits.

Dans le puits de contrôle, les facteurs de croissance et les autres nutriments du milieu favorisent la différenciation des cellules souches neurales en ostéoblastes.

À l’aide de techniques de coloration appropriées, colorez les cellules à l’aide de marqueurs spécifiques aux ostéoblastes et colorez le noyau avec un colorant fluorescent bleu.

L’absence de marqueurs spécifiques aux ostéoblastes dans les cellules réduites au silence indique leur incapacité à se différencier.

Pour effectuer l’inactivation des siRNA dans les cellules O9-1, récupérez et ensemencez les cellules. Diluez les liposomes dans un volume approprié de milieu sans sérum. Ensuite, diluez les siRNA dans des milieux sans sérum selon le protocole textuel. Après cela, ajoutez le siRNA dilué aux liposomes dilués selon les instructions du fabricant. Mélangez la solution par pipetage et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un volume approprié de complexe siRNA-lipide aux cellules. Ensuite, incubez les cellules pendant 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire standard. Les cellules O9-1 peuvent se différencier en différents types de cellules dans des conditions de culture de différenciation spécifiques. Pour différencier les cellules O9-1 en ostéoblastes, préparez des milieux de différenciation ostéogénique selon le protocole de texte. Enfin, détecter le marqueur ostéoblastique ostéocalcine dans les ostéoblastes différenciés par immunomarquage.