Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 2:38 min • July 8th, 2025
Commencez par une culture adhérente de colonies de cellules progénitrices neurales induites dérivées de fibroblastes humains adultes dans une plaque multipuits recouverte de laminine.
Lavez les colonies avec un tampon pour éliminer les cellules non adhérentes, puis ajoutez un tampon frais.
Grattez autour des colonies individuelles pour éliminer les cellules environnantes.
Transférez les colonies dans des puits frais recouverts de laminine contenant un milieu de neuroinduction.
Désagréger mécaniquement les colonies pour obtenir une suspension unicellulaire.
La laminine, une protéine de la matrice extracellulaire, interagit avec les protéines de surface des progéniteurs, facilitant l’adhésion cellulaire à la surface du puits.
Ajoutez une petite molécule inhibitrice qui pénètre dans les cellules et bloque des protéines kinases spécifiques, empêchant ainsi l’apoptose cellulaire.
Les facteurs de croissance et les petites molécules présentes dans le milieu de neuroinduction facilitent la prolifération des progéniteurs.
Remplacez périodiquement le milieu pour reconstituer les nutriments, facilitant ainsi la prolifération continue des progéniteurs.
Une culture confluente, ou une couche cellulaire entièrement recouverte, indique l’expansion réussie des cellules progénitrices neurales induites.
Un jour plus tard, aspirez la laminine des plaques et ajoutez 200 microlitres de milieu d’induction neurale dans les puits. Lavez les plaques à six puits contenant les colonies à cueillir, une fois avec du DPBS, avant d’ajouter 2 millilitres de milieu d’induction neurale par puits d’une plaque à six puits.
Prélevez mécaniquement les cellules en grattant autour des colonies à l’aide d’une aiguille fine pour vous débarrasser des cellules environnantes, et en prélevant les colonies à l’aide des pointes de pipette montées sur un homme pipette de 200 microlitres réglé sur 50 microlitres.
Transférez chaque colonie dans un puits d’une plaque de 48 puits recouverte de laminine et générez mécaniquement une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas 10 fois. Ajouter l’inhibiteur de la rho-kinase dans une concentration finale de 10 micromolaires dans les cellules. Faites pousser les cellules sur la plaque à 48 puits à 37 degrés Celsius, 5 % de CO2 pendant deux jours. Changez de milieu tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % à 90 % de confluence.