Méthode modifiée de tube rouleau pour la culture à long terme de tranches de cerveau de rongeur

Prenez des tranches de cerveau obtenues à partir d’un cerveau de rongeur. Les tranches sont constituées de l’hippocampe, qui contient des neurones de l’hippocampe.

Transférez les tranches de cerveau dans des lamelles contenant du plasma de poulet.

Appliquez du plasma mélangé à de la thrombine sur les tranches. La thrombine induit la coagulation plasmatique, créant un échafaudage biologique qui favorise l’adhésion des tranches aux lamelles.

Prenez des tubes à rouleaux à côtés plats avec un trou sur le côté plat et un disque adhésif fixé autour du trou à l’extérieur des tubes.

Positionnez les lamelles sur les disques adhésifs, en vous assurant que les tranches de cerveau font face à l’intérieur des tubes.

Ajoutez un milieu de culture neuronal dans les tubes et faites couler un mélange de dioxyde de carbone et d’air.

Boucher les tubes, les insérer dans un support à roulettes et les incuber avec un mouvement de roulement.

L’aération fournie par l’incubation roulante et les nutriments du milieu soutiennent la culture à long terme des tranches de cerveau.

Pour commencer, préparez le support de tube à rouleaux et fabriquez un gabarit pour aider à percer un trou dans les tubes à rouleaux, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. À l’aide du gabarit, maintenez en position un tube de culture en plastique de 1 centimètre à côté plat de manière à ce que le côté plat soit vers le haut. Ensuite, percez un trou de 6 millimètres de diamètre avec le centre à 1 centimètre du bas et centré entre les côtés du tube.

À l’aide de l’outil d’ébavurage pivotant, lissez les bords du trou et faites quatre rainures sur le bord intérieur du trou pour faciliter le drainage du trou pendant la rotation. Ensuite, rincez les tubes avec de l’éthanol à 70 %, puis faites-les sécher à l’air libre dans une enceinte de sécurité biologique. Stérilisez les tubes avec des disques en caoutchouc de silicone adhésifs perforés de 12 millimètres pendant 40 minutes sous la lampe UV.

Après 20 minutes, repositionnez les tubes et les disques de manière à ce que toutes les surfaces exposées soient stérilisées. Ensuite, décollez le support blanc du disque adhésif. Alignez les trous et fixez le caoutchouc de silicone à l’extérieur du tube.

Une fois les tranches obtenues, placez 2 microlitres de plasma de poulet au centre de la face photodécoupée d’une lamelle préparée. Répartissez légèrement le plasma pour obtenir un point de 3 à 4 millimètres de diamètre. Ensuite, utilisez une spatule stérile à pointe étroite pour soulever une tranche de cerveau préparée. À l’aide d’une pince fermée, maintenez la tranche sur la pointe de la spatule tout en soulevant la tranche. Touchez la spatule au point de plasma sur la lamelle et, à l’aide d’une pince fermée, poussez la tranche sur la lamelle.

Ajoutez une fine couche de plasma de poulet sur la lamelle avant de placer la tranche et une quantité minimale de plasma traité à la thrombine pour couvrir la tranche. Si la tranche flotte, elle ne restera pas collée lorsque le caillot sera retiré.

Ensuite, mélangez 2,5 microlitres de plasma et 2,5 microlitres de thrombine dans un tube séparé. Placez rapidement 2,5 microlitres de ce mélange sur et autour de la tranche, et pipetez doucement de haut en bas pour la mélanger. Retirez le revêtement en plastique transparent de la face exposée de l’adhésif en caoutchouc de silicone précédemment fixé sur le tube du rouleau. Ensuite, placez la lamelle avec la tranche de cerveau sur l’adhésif, en alignant la tranche dans le trou.

Pour assurer l’adhérence, appliquez une pression douce et uniforme sur la lamelle avec le pouce en appuyant uniformément sur la lamelle et en la maintenant pendant environ 1 minute tout en la transférant dans l’enceinte de sécurité biologique.

La pression exercée sur la lamelle pour l’adhère au tube sans fuir doit être parfaite et maintenue suffisamment longtemps pour éliminer les canaux d’air dans le produit d’étanchéité. Trop de pression fissurera la lamelle.

Dans une enceinte de sécurité biologique, ajoutez 0,8 millilitre de milieu de culture neurobasal A complet dans chaque tube. Ensuite, faites passer un mélange de 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’air à travers une pipette de pâturage stérile bouchée de coton maintenue solidement par une pince. Utilisez-le pour rincer le tube du rouleau avec le mélange gazeux et boucher rapidement le tube lorsqu’il est retiré de la pipette.

Ensuite, étiquetez les tubes avec le numéro de tranche et le numéro de panier. Insérez les tubes dans un support à roulettes, en veillant à ce qu’ils soient géométriquement équilibrés. S’il y a un nombre impair de tubes, ajoutez des tubes vierges pour équilibrer.

Placez les supports dans un incubateur à rouleaux à 35 degrés Celsius avec des rouleaux tournant le support pour maintenir le fluide au fond des tubes. Inclinez l’incubateur vers l’arrière d’environ 5 degrés en soulevant son avant sur une planche.