Initiation de l’extension rapide des neurites et de la formation de connexions neuronales fonctionnelles

Commencez par assembler un dispositif microfluidique contenant des microcanaux dans une parabole recouverte de lysine.

Ensemencez les neurones embryonnaires avec un milieu de croissance dans les puits microfluidiques, leur permettant de circuler à travers les microcanaux.

Incuber pour faciliter l’attachement et la croissance neuronaux, formant des populations neuronales physiquement isolées.

Démontez l’installation et placez la parabole dans une chambre de micromanipulateur avec un flux salin pour maintenir la viabilité cellulaire.

Introduisez des billes enrobées de lysine près des neurones, permettant aux neurites ou aux projections cellulaires de se fixer et de former des complexes billes-neurites.

À l’aide d’un micromanipulateur, appliquez une aspiration pour engager un complexe bille-neurite à partir d’un canal.

Tirez sur ce complexe pour induire une tension mécanique, conduisant à une extension rapide des neurites.

Guidez-le vers un autre complexe perle-neurone et maintenez-le avec un deuxième micromanipulateur.

Gardez les deux billes en place pour faciliter la formation d’une connexion névritique.

Relâchez l’aspiration et remplacez la solution saline par un milieu de culture.

Incuber pour établir des connexions fonctionnelles entre les neurones, favorisant la communication par les neurotransmetteurs.

Retirez le fluide des puits supérieurs des dispositifs microfluidiques sans vider les puits. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de la solution cellulaire concentrée dans le puits supérieur droit du dispositif microfluidique, et vérifiez au microscope comment les cellules circulent à l’intérieur du dispositif microfluidique à population unique.

Pour plaquer les cellules dans le dispositif de plusieurs populations, ajoutez 20 microlitres de la solution cellulaire concentrée dans chacun des puits supérieurs. Au microscope, vérifiez si les cellules se trouvent à l’intérieur des chambres. Ensuite, placez les appareils dans l’incubateur pendant 15 à 30 minutes pour favoriser la fixation des cellules au substrat.

Une fois que les cellules se sont fixées au substrat, ajoutez 40 microlitres de NBM dans les deux puits supérieurs du dispositif de population unique. Cela aidera à éliminer les bulles d’air des microcanaux. Ajoutez 20 microlitres de NBM dans les puits supérieurs du dispositif à populations multiples, les mêmes puits où les cellules ont été injectées. Le milieu doit dépasser légèrement pour former un ménisque positif et donner aux puits un aspect de muffin-top.

Un à deux jours avant le retrait des dispositifs microfluidiques, ajoutez 2 millilitres de NBM préchauffé dans chaque plat d’échantillon et inondez les chambres. Ensuite, conservez les appareils dans l’incubateur. Par la suite, utilisez une pince à épiler stérile et une pointe de pipette pour retirer les dispositifs microfluidiques des lamelles, laissant une configuration à motifs de neurones.

Dans cette procédure, ajoutez 40 à 60 microlitres des billes préparées enrobées de PDL à la culture cellulaire. Ensuite, retournez l’échantillon dans l’incubateur pendant une heure pour favoriser la formation de contacts synaptiques. Ensuite, installez l’échantillon dans un dispositif expérimental de sorte que les cellules puissent être évaluées d’en haut par deux micropipettes et également accessibles optiquement. Dans cette configuration, une caméra CCD est située sur le port latéral du microscope pour la capture d’images. Connectez chaque pipette remplie de solution saline à une seringue de 1 millilitre. Ensuite, imprégnez l’échantillon d’une solution saline physiologique.

Ensuite, au microscope, vérifiez l’écart entre les deux populations neuronales isolées pour vous assurer que les deux populations ne sont pas naturellement connectées. Sélectionnez une perle PDL qui n’est pas attachée au neurone dans le champ de vision. Alignez la perle à l’aide d’une pointe de micropipette en vous concentrant sur la perle puis sur la micropipette.

Par la suite, abaissez la pointe le plus près possible de la perle en la surveillant au microscope. Ensuite, appliquez une pression négative sur la pipette pour ramasser la perle et maintenez la pression négative tout au long de l’expérience.

Maintenant, sélectionnez une perle PDL attachée à un neurone dans le champ de vision et fixez-la à la deuxième micropipette à l’aide de l’aspiration. Tirez le complexe bille-neurone PDL en déplaçant lentement le micromanipulateur ou l’étage d’échantillon à 0,5 micromètre par minute pour 1 micromètre, et faites une pause de cinq minutes pour permettre l’initiation des neurites.

Tirez le complexe perle-neurone PDL en le déplaçant lentement latéralement à 0,5 micromètre par minute sur 2 micromètres. Ensuite, faites une pause de cinq minutes pour permettre l’élongation des neurites. Après une initiation réussie et une extension du neurite sur les 5 premiers micromètres, tirez continuellement le neurite à 20 micromètres par minute.

Pour connecter les neurones, sélectionnez une région riche en neurites. Utilisez d’autres billes pour mesurer la hauteur de la pointe de la pipette au-dessus de la lamelle et abaissez le complexe perle-neurite PDL afin qu’il entre physiquement en contact avec les neurites. Laissez le complexe bille PDL-neurite en contact avec le neurite cible tout en manipulant la deuxième micropipette. Ensuite, abaissez la deuxième pipette avec la deuxième perle PDL sur le neurite nouvellement formé à environ 20 micromètres de la première perle, et utilisez la deuxième perle PDL pour pousser le nouveau filament de neurite vers la cellule cible.

Ensuite, maintenez les deux perles en place pendant au moins une heure. Vérifiez l’absence de gonflement focal, d’épaississement des neurites en contact avec la bille avec le microscope. Pendant ce temps, changez lentement le milieu de l’échantillon de la solution saline physiologique à la NBM préchauffée équilibrée en dioxyde de carbone.

Libérez la perle de la deuxième pipette en relâchant l’aspiration. Si le nouveau neurite reste attaché, relâchez également la première vitesse. Ensuite, replacez soigneusement l’échantillon dans l’incubateur afin de renforcer la connexion neuronale pour les expériences futures.