Génération de neurones en reprogrammant des cellules de fibroblastes dermiques humains

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Neurosciences

0 vues • 3:32 min • July 8th, 2025

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Introduire des fibroblastes dermiques humains adultes ou aHDF, en suspension dans un milieu de fibroblastes, dans une microplaque recouverte de protéines de matrice extracellulaire. Incuber pour permettre l’adhésion cellulaire.

Introduire un vecteur lentiviral transgénique. Lors de l’internalisation dans la cellule hôte, l’ARN viral est retranscrit en ADN, qui s’intègre dans le génome de l’hôte.

L’ADN viral exprime des facteurs de transcription et des ARN en épingle à cheveux courts, ou shRNA. Les nucléases cellulaires transforment les shRNA en petits ARN interférents ou siRNA.

Les siARN générés dégradent l’ARNm codant pour les répresseurs transcriptionnels, inhibant ainsi leur expression et permettant l’activation des gènes de différenciation neuronale.

Les facteurs de transcription activent les gènes, favorisant la différenciation neuronale des aHDF.

Retirez le milieu contenant les vecteurs non internalisés.

Ajoutez un milieu de conversion neuronale précoce contenant des facteurs de croissance et de petites molécules qui induisent la différenciation en cellules neuronales.

Remplacer le milieu par un milieu de conversion neuronale tardive contenant des facteurs neurotrophiques pour la maturation en neurones.

Les neurones matures sont prêts pour les tests en aval.

Préparez une suspension cellulaire de 1 320 000 cellules dans 13,2 millilitres de milieu fibroblastique afin d’obtenir 100 000 cellules par millilitre de milieu. Après avoir aspiré la gélatine de la plaque, lavez deux fois la plaque avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de suspension cellulaire dans chacun des puits et incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Chaud 13,2 millilitres de fibroblaste moyen à 37 degrés Celsius. Ensuite, décongelez le vecteur lentiviral dans le capuchon laminaire à température ambiante. Ajoutez le volume requis de lentivirus nécessaire pour infecter les fibroblastes dermiques humains adultes à une multiplicité d’infection de 20 au milieu sans aucun amplificateur de transduction.

Ensuite, remplacez le milieu par 500 microlitres de milieu fibroblastique avec l’ajout du vecteur lentiviral. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, remplacez le milieu contenant le lentivirus par un milieu de fibroblastes frais sans vecteur lentiviral. Le troisième jour après la transduction virale, retirez le milieu de fibroblaste et ajoutez 500 microlitres de milieu de conversion neuronale précoce.

Deux ou trois fois par semaine, remplacez 225 microlitres d’ancien milieu de chaque puits par 250 microlitres de milieu de conversion neuronale frais et précoce. Le 18e jour après la transduction virale, retirez le milieu de conversion neuronale précoce et remplacez-le par 500 microlitres de milieu de conversion neuronale tardive. Continuez à changer de milieu tous les deux à trois jours comme auparavant jusqu’au 25e jour ou au point final expérimental.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026