Développement d’un modèle de culture cellulaire triple de la barrière hémato-encéphalique humaine

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurosciences

0 vues • 3:44 min • July 8th, 2025

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Commencez par ajouter des péricytes sur la face inférieure du puits d’insertion.

Couvrez l’insert avec une plaque de culture et incubez.

Les péricytes se fixent à la membrane du puits d’insertion, formant une couche unicellulaire ou une monocouche.

Prenez une autre assiette de culture.

Ajoutez des astrocytes humains dans le puits dans un milieu approprié. Ensuite, incubez l’assiette.

Les astrocytes se fixent au fond du puits et forment une monocouche.

Jetez le milieu et ajoutez du milieu frais d’astrocytes et de péricytes.

Maintenant, prenez la plaque de culture contenant le puits avec la couche de péricyte.

Retournez la plaque et transférez l’insert du puits dans le puits contenant la couche d’astrocytes.

Ajoutez les cellules endothéliales du cerveau humain sur la face supérieure du puits et incubez.

Les cellules endothéliales se fixent à l’insert du puits, formant un système de culture cellulaire triple qui ressemble à la barrière hémato-encéphalique, une interface cruciale séparant la circulation sanguine et le cerveau.

Commencez par cultiver l’HBVP dans des flacons de culture T75 avec une surface activée pour l’adhésion cellulaire à l’intérieur d’un incubateur de dioxyde de carbone à 5 % à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit confluent. Une fois la confluence atteinte, aspirez l’ancien milieu parasitaire et lavez les cellules avec 5 millilitres de PBS Dulbecco chaud. Aspirez le PBS de Dulbecco et détachez les cellules du flacon, en utilisant une combinaison de 4 millilitres de solution chaude de trypsine-EDTA et de 1 millilitre de PBS de Dulbecco.

Incuber le ballon pendant 5 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone. Observez au microscope pour confirmer si les cellules sont détachées du flacon. Ajoutez 5 millilitres de milieu parasite chaud, contenant 2 % de FBS dans le ballon, et transférez les cellules détachées dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire pendant trois minutes à 200 g, en laissant les cellules former une pastille au fond du tube.

Aspirez le fluide du tube, en veillant à ce que la pastille de cellule reste intacte. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu parasitaire. Calculez la quantité de fluide, en fonction de la confluence des cellules et du nombre d’inserts de puits nécessaires. Prenez 10 microlitres de cellules remises en suspension. Placez-les dans une lame de comptage de cellules et comptez le nombre de cellules.

Déterminez la densité cellulaire et ensemencez 300 000 cellules par insert dans 1 millilitre de milieu parasite sur le côté luminal des inserts de puits. Cultivez des astrocytes humains primaires en utilisant le milieu astrocytaire, contenant 2 % de FBS, comme décrit dans le manuscrit du texte. Déterminez la densité cellulaire et ensemencez 300 000 cellules par puits au fond des plaques de culture tissulaire à 6 puits. Couvrez l’assiette pour éviter l’évaporation et incubez toute la nuit.

Sortez les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes dans les inserts contenant les péricytes de l’incubateur. Aspirez le milieu astrocytaire des plaques à 6 puits de culture tissulaire et ajoutez 1 millilitre de milieu parasite et 1 millilitre de milieu astrocytaire dans chaque puits.

Aspirez le milieu péricytaire des inserts de puits et placez-le dans les plaques de culture tissulaire à 6 puits contenant les astrocytes ensemencés. Semez HBMEC à une densité de 300 000 cellules par puits dans 2 millilitres de milieu classique complet sur la face apicale des mêmes inserts de puits.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026