Encyclopédie des expériences JoVE
Neurosciences
0 vues • 4:02 min • July 8th, 2025
Commençons par les gliomasphères, des agrégats cellulaires dérivés d’une tumeur cérébrale ou d’un glioblastome.
Ajouter des enzymes de dissociation. Incuber pour séparer les cellules du glioblastome et obtenir une suspension unicellulaire.
Ensuite, introduisez un milieu de culture enrichi en sérum pour arrêter l’activité enzymatique.
Centrifugez et retirez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension.
Filtrez la suspension, puis centrifugez-la et retirez le surnageant.
Remettre les cellules en suspension dans des précurseurs d’hydrogel qui contiennent de petits peptides.
Chargez ce mélange dans des puits avec un moule en silicone pré-assemblé contenant de l’acide hyaluronique.
Mélangez la solution. Incuber pour permettre l’interaction entre l’acide hyaluronique et les précurseurs de l’hydrogel, formant un hydrogel qui facilite le piégeage cellulaire.
Superposez l’hydrogel avec un milieu de culture pour maintenir la survie cellulaire.
Après avoir démonté le moule, incubez l’hydrogel.
Au sein de l’hydrogel, les protéines d’adhésion des cellules interagissent avec les peptides précurseurs et l’acide hyaluronique.
Cela amène les cellules à former de petits amas et à développer une culture tridimensionnelle.
Pour commencer, placez des moules en caoutchouc de silicone propres et secs dans chaque puits d’une plaque à 12 puits non traitée pour la culture tissulaire, et utilisez l’extrémité émoussée propre d’une pointe de pipette pour faire adhérer les moules au fond de la plaque. Après avoir vérifié l’étanchéité entre les moules et les fonds de puits, récupérez les sphères de gliome dissociées d’une culture cellulaire de glioblastome par centrifugation, et remettez en suspension la pastille dans un millilitre d’enzyme de dissociation cellulaire.
Après cinq minutes à température ambiante, agitez le tube en tapotant doucement et arrêtez la réaction enzymatique avec quatre millilitres de milieu complet. Centrifugez à nouveau les cellules et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu complet frais avant de filtrer les cellules à travers un filtre de 70 micromètres. Lavez la passoire avec quatre millilitres supplémentaires de fluide complet et divisez la suspension en deux aliquotes de 8 x 104 cellules par tube de centrifugation.
Récupérez les cellules par centrifugation et remettez en suspension une pastille dans 80 microlitres de maléimide de polyéthylène glycol fraîchement préparé, ou PEG-Mal-RGD, et une pastille dans 80 microlitres de solution PEG-Mal-CYS fraîchement préparée par moule. À l’aide d’une pointe de micropipette à large orifice de 200 microlitres, ajoutez 40 microlitres de solution d’acide hyaluronique dans chaque moule en silicone en caoutchouc, suivis de 40 microlitres de la solution cellulaire PEG-Mal-CYS ou PEG-Mal-RGD, en pipetant rapidement de haut en bas pas plus de 10 fois par moule pour mélanger.
En raison du temps de gélification rapide, une fois que les deux composants de l’hydrogel sont mélangés, il est important d’utiliser une pointe de pipette à large orifice pour mélanger les solutions rapidement mais complètement. Cette étape demande de la pratique.
Ensuite, placez les cellules encapsulées dans du gel dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant 5 à 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 2 à 2,5 millilitres de milieu de culture à chaque gel et utilisez une pointe de pipette stérile de deux microlitres et une pince pour séparer délicatement les gels des parois des moules. Ensuite, à l’aide d’une pince stérilisée, retirez les moules des puits de la plaque et remettez la plaque dans l’incubateur cellulaire.