Analyse de la survie des cellules de Purkinje dans des cultures de coupes cérébelleuses organotypiques

Commencez avec un cerveau de chiot de souris.

Isolez le cervelet et obtenez des coupes de tissu d’épaisseur appropriée.

Transférez les tranches sur des inserts membranaires placés dans des puits de plaque de culture contenant le milieu.

Dans les puits traités, le média contient un composé d’essai neuroprotecteur. Les puits de contrôle n’ont pas le composé. Couver.

Dans des conditions de contrôle, les cellules cérébelleuses de Purkinje subissent une apoptose, imitant le développement postnatal précoce in vivo.

Dans les puits traités, en fonction de son potentiel, le composé peut protéger les cellules de l’apoptose.

Lavez les tranches et fixez-les pour préserver l’intégrité cellulaire.

Transférez les tranches dans une solution de blocage de la perméabilisation pour perméabiliser les membranes cellulaires et bloquer les sites de liaison non spécifiques.

Superposition avec des anticorps primaires ciblant une protéine de liaison au calcium spécifiquement exprimée dans les cellules de Purkinje.

Laver et introduire des anticorps secondaires conjugués aux fluorophores ciblant les anticorps primaires.

Contre-colorez les noyaux avec un colorant de liaison à l’ADN et montez les tranches.

À l’aide d’un microscope confocal, quantifiez les cellules de Purkinje viables pour identifier le potentiel neuroprotecteur du composé testé

Pour prélever le cervelet, utilisez une pince à pansement droite pour saisir la tête du chiot par le nez et utilisez des ciseaux à œil droits pour ouvrir le cuir chevelu de l’extrémité postérieure latéralement à la ligne médiane. Ouvrez le crâne de la même manière, en pointant les pointes des ciseaux vers l’extérieur pour éviter d’endommager le cervelet, et utilisez une spatule pour transférer le cerveau dans une boîte de 60 millimètres contenant du HBSS froid et 5 milligrammes par millilitre de glucose.

Utilisez la pince à pansement droite pour disséquer soigneusement le cervelet et utilisez une pince fine incurvée stérile pour placer le tissu sur un disque en plastique sur la table de coupe d’un hachoir à tissus. Tournez la table de coupe pour orienter le tissu afin de permettre l’acquisition de sections parasagittales, et tirez le bouton de déverrouillage de la table vers la droite pour déplacer la table de coupe jusqu’à ce que la lame soit positionnée sur le bord du tissu. Ensuite, ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 micromètres et la vitesse de la lame à moyenne et démarrez le hachoir. Lorsque tout le cervelet a été tranché, éteignez le hachoir.

À l’aide d’une pince stérile, tenez le disque au-dessus d’une nouvelle parabole de 60 millimètres. À l’aide d’une pipette de transfert, rincez le HBSS et le glucose sur le disque afin que les tranches tombent dans le plat. Ensuite, en touchant les échantillons le moins possible, utilisez une microsonde pour séparer les tranches.

À l’aide de la pipette de transfert, sélectionnez les sections du cervelet proches du vermis sur des inserts de culture cellulaire individuels dans la plaque à six puits, et utilisez la microsonde pour positionner les tranches au centre de chaque insert. Lorsque toutes les tranches ont été placées, aspirez soigneusement tout excès de HBSS et de glucose et remettez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire.

Pour la coloration par immunofluorescence, retirez le surnageant de chaque puits et lavez les inserts avec du PBS. Fixez les tranches avec 1 millilitre de paraformaldéhyde froid à 4 % dans le puits de chaque insert, et 500 microlitres sur le dessus de chaque insert pendant 1 heure.

À la fin de la fixation, lavez les inserts quatre fois pendant 10 minutes avec 1 millilitre de PBS frais sous chaque insert et 500 microlitres de PBS frais sur chaque insert par lavage sur un agitateur orbital. Préremplissez chaque puits d’une plaque de 24 puits avec 500 microlitres de PBS-TB et utilisez un pinceau pour transférer les tranches cérébelleuses de chaque insert de culture cellulaire dans les puits individuels d’une plaque de 24 puits.

Perméabiliser et bloquer les tranches à température ambiante pendant une heure. À la fin de l’incubation, étiqueter les cellules avec 200 microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt dilué dans du PBS-TB par puits pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur l’agitateur orbitaire.

Le lendemain matin, lavez les tranches quatre fois pendant 10 minutes et 500 microlitres de PBS frais par lavage sur le shaker avant d’étiqueter les échantillons avec les anticorps secondaires conjugués aux fluorophores appropriés pendant deux heures à température ambiante sur le shaker à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, contre-colorez les sections avec 500 microlitres d’une coloration nucléaire appropriée par puits pendant 10 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière, et utilisez une pipette de transfert pour monter les tranches sur des lames de verre.

Ensuite, laissez les sections sécher complètement à l’air libre avant de les réhydrater avec du PBS et de monter les mouchoirs avec des lamelles recouvertes d’environ 80 microlitres de support de montage. Une fois que le milieu de montage a durci, les sections cérébelleuses sont prêtes à être imagées.