Génération d’une culture organoïde à partir d’une suspension de cellules tumorales cérébrales

Commencez avec un tube de microcentrifugation contenant une matrice extracellulaire riche en laminine ou lrECM. La laminine est un composant structurel présent en abondance dans le cerveau.

Gardez le tube sur de la glace pour éviter la polymérisation de l’IrECM.

Ajoutez des cellules tumorales cérébrales et mélangez soigneusement pour assurer une distribution uniforme des cellules.

Ensuite, transférez le mélange sur des moules en parafilm en formant des gouttelettes.

Incuber pour faciliter la polymérisation de la lrECM afin de former un échafaudage, imitant l’environnement naturel des cellules.

Maintenant, rincez les organoïdes solidifiés dans une boîte de Pétri contenant un milieu de culture, puis incuber.

Le milieu de culture fournit des nutriments essentiels et des facteurs de croissance, favorisant la division cellulaire.

Au sein de l’organoïde, les cellules s’auto-organisent en migrant et en envahissant.

Après l’incubation, inclinez la plaque pour déposer les organoïdes.

Retirez délicatement l’excédent de milieu et ajoutez-y du milieu frais.

Incuber en secouant doucement.

Cela répartit uniformément les nutriments et améliore la croissance des organoïdes.

Pour fabriquer des organoïdes à partir d’une suspension unicellulaire, ajoutez une quantité appropriée de matrice extracellulaire riche en laminine ou lrECM dans un petit tube à centrifuger dans un seau à glace ou un bloc froid.

Préparez un mélange de cellules contenant 20 000 cellules par organoïde. Mélangez soigneusement le mélange de suspension cellulaire lrECM pour éviter de déposer les cellules, ce qui entraînerait une formation d’organoïdes non uniforme. Ensuite, pipetez soigneusement 20 microlitres du mélange sur un moule en parafilm pour former une gouttelette semblable à une perle. Assurez-vous de refroidir la pointe de la pipette tous les deux à trois organoïdes pour éviter la polymérisation de lrECM.

Une fois que le nombre souhaité d’organoïdes est pipeté sur le moule en parafilm dans une plaque de culture de 10 centimètres, incubez les organoïdes à 37 degrés Celsius pendant 1 à 2 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Une fois les organoïdes solidifiés, rincez doucement les organoïdes du moule de parafilm avec un milieu NBMC à l’aide d’une pointe P1000, et rassemblez-les dans une nouvelle plaque de culture de 10 centimètres contenant 20 millilitres de NBMC. Placez la plaque de culture dans un incubateur sans secouer pendant 4 jours.

Après 4 jours, replacez le support dans la plaque. Pour ce faire, placez un morceau de papier foncé sous la plaque de culture cellulaire. Inclinez la plaque et attendez 20 secondes. Une fois que les organoïdes se déposent complètement au fond du plat, retirez lentement le support à l’aide d’une pipette en verre à grande ouverture.

Après avoir ajouté de nouveaux milieux, placez la plaque dans l’incubateur sur un agitateur orbital à 80 tr/min, et changez ensuite de média tous les 2 à 3 jours.