JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurosciences
0 vues • 4:08 min • July 8th, 2025
Commençons par des colonies de cellules souches pluripotentes induites par l’homme cultivées sur une matrice de membrane basale adhérente.
Ajoutez un milieu de différenciation cérébelleuse contenant une hormone spécifique, un facteur de croissance et des inhibiteurs de petites molécules.
Soulevez les colonies à l’aide d’une pipette en verre et transférez-les sur une plaque de fixation ultra-basse.
La surface à faible fixation maintient les cellules en suspension, facilitant leur agrégation en corps embryoïdes tridimensionnels, ou EB.
L’hormone, le facteur de croissance et les inhibiteurs se lient à leurs sites cibles respectifs, favorisant la différenciation des cellules souches en progéniteurs neuronaux.
Transférez les EB dans des puits de plaque de culture recouverts d’un polymère synthétique et d’une protéine d’adhésion pour faciliter la fixation des EB.
Remplacez le milieu par un milieu de différenciation sans inhibiteur.
Les cellules commencent à migrer vers l’extérieur des EB, formant une monocouche 2D.
Retirez le milieu et ajoutez un milieu de maturation cérébelleux.
Les facteurs de croissance dans le milieu induisent la maturation des progéniteurs neuronaux en précurseurs neuronaux cérébelleux distincts.
Le jour zéro, ajoutez 1 millilitre de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y27632 et SB431542 à chaque puits d’une plaque d’attache ultra-basse à six puits ou ULA, et placez-le dans l’incubateur jusqu’à ce que les colonies soulevées soient prêtes à être ajoutées aux puits. Nettoyez les cellules différenciées à l’aide d’une pipette en verre tiré. Aspirez le milieu et ajoutez 1 millilitre de solution de passage iPSC pour chaque parabole de 35 millimètres.
Après trois minutes d’incubation à 37 degrés Celsius, aspirez le milieu et ajoutez 2 millilitres de milieu de différenciation cérébelleuse complété par 10 micromolaires Y27632 et SB431542. Sous un grossissement de 4X d’un microscope à lumière inversée transmise, soulevez les colonies à l’aide du bord courbé de la pipette en verre tiré. Une fois que chaque colonie est levée, transférez doucement toutes les colonies dans un puits de la plaque ULA à 6 puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Répétez ce processus pour chaque plaque iPSC et incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Le jour 2, ajoutez du FGF2 dans chaque puits pour ajuster une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre. Le jour 7, changez un tiers du milieu en aspirant 1 millilitre de milieu épuisé et en le remplaçant par 1 millilitre de milieu de différenciation cérébelleux frais. Incuber les corps embryoïdes pendant sept jours.
Le 14e jour, faites tourner l’assiette pour rassembler tous les corps embryoïdes au centre de l’assiette. Ensuite, inclinez la plaque et aspirez tout le milieu épuisé à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres à partir du bord. Au fur et à mesure que la quantité moyenne diminue, posez lentement la plaque à plat et continuez à aspirer, en laissant suffisamment de milieu pour éviter de dessécher les corps embryoïdes.
Ensuite, ajoutez 3 millilitres de milieu de différenciation cérébelleux frais complété par 10 micromolaires. Y27632. Ensuite, transférez les corps embryoïdes à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres dans une boîte recouverte de poly-L-Ornithine laminine. Le 15e jour, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de différenciation cérébelleux frais.