Culture et maintien de neurones dopaminergiques à partir de tissu cérébral embryonnaire de souris

Traitez le tissu embryonnaire du mésencéphale, riche en neurones dopaminergiques en développement, avec une solution de trypsine-EDTA pour les détacher de la matrice tissulaire.

Ajoutez un milieu de désactivation pour inhiber l’activité enzymatique, puis lavez pour éliminer les enzymes résiduelles.

Pipeter le tissu à plusieurs reprises. Les neurones embryonnaires possèdent moins de projections, ce qui réduit le stress lors de cette perturbation et génère une suspension unicellulaire.

Centrifugez et retirez le surnageant, puis remettez les neurones en suspension dans un milieu complet. Transférez ces neurones sur une lamelle recouverte de polymère pour la fixation des cellules.

Placez la lamelle dans une plaque multi-puits avec un milieu complet, fournissant des nutriments et des facteurs de croissance essentiels à la croissance des neurones.

Les antibiotiques contenus dans le milieu empêchent la croissance bactérienne, favorisant ainsi la viabilité neuronale.

Au fur et à mesure que les neurones grandissent et mûrissent, ils développent des projections cellulaires, telles que des axones et des dendrites, formant des connexions synaptiques.

De temps en temps, retirez la moitié du média utilisé pour éliminer les sous-produits toxiques.

Ajoutez un milieu frais pour le maintien à long terme des neurones dopaminergiques.

Sous un capot, retirez le HBSS de la collection du mésencéphale ventral. Ensuite, ajoutez un millilitre de trypsine-EDTA tiède à 0,05 %, assez de solution pour 12 morceaux de tissu. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes. Sous le capot, remplacez la trypsine-EDTA par 1 millilitre de milieu de désactivation.

Agitez doucement le mélange, puis retirez le milieu de désactivation, mais laissez suffisamment de milieu derrière vous pour que les cellules dissociées ne soient pas jetées. Ensuite, lavez les tissus avec un milieu complet deux fois sans perdre les cellules. Maintenant, ajoutez 1 millilitre de milieu complet. Ensuite, triturez le tissu avec la pipette polie au feu, sans former de bulles jusqu’à l’obtention d’une suspension unicellulaire. Environ 8 à 10 passages devraient suffire.

Après la trituration, centrifugez les cellules de 400 g pendant 5 minutes. Retirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans 1 millilitre de milieu complet. Pipetez les cellules jusqu’à 4 fois pour obtenir une suspension. Commencez par compter et évaluer la santé des cellules dans la suspension à l’aide de l’exclusion au bleu de trypan avec un hémocytomètre.

Maintenant, ajustez la suspension des cellules à 1 500 cellules par microlitre. Ensuite, transférez les capuchons stérilisés des tubes de microcentrifugation dans des boîtes de 100 millimètres. Placez les lamelles préparées sur les capuchons à l’aide d’une pince. Ne lavez pas les lamelles et essayez de ne pas les laisser sécher. Chargez 100 microlitres de suspension sur chaque lamelle.

Cette méthode quelque peu inhabituelle offre une viabilité de culture de 90 % et constitue une étape essentielle au succès. Ensuite, fermez la boîte de Pétri et transférez-la dans l’incubateur pendant une heure. Après l’incubation, transférez soigneusement les lamelles avec le milieu dans des plaques à 24 puits, contenant 400 microlitres de milieu complet chauffé à 37 degrés Celsius dans chaque puits. Ensuite, incubez les cellules pendant la nuit.

Les premières heures sont les plus critiques pour la survie cellulaire. Dans les 24 heures, ajoutez délicatement un demi-millilitre de milieu complet dans chaque puits. Toutes les 2 semaines, changez la moitié des supports. Si la culture devient jaune, le changement de demi-média peut être effectué plus tôt, mais le changement doit encore être peu fréquent. Les neurones dopaminergiques survivront plus de 6 semaines dans ces conditions.