Isolement et culture de progéniteurs de neurones granulaires cérébelleux murins

Prenez le chiot souris cerebella.

Homogénéisez-les en fragments plus petits.

Ajoutez une enzyme protéolytique pour digérer la matrice extracellulaire du tissu, en desserrant les progéniteurs granulaires cérébelleux, ou CGNP, et les astrocytes.

Ajouter un milieu de culture CGNP contenant du sérum pour arrêter l’activité enzymatique. Centrifugez et jetez le surnageant riche en enzymes.

Remettre en suspension les fragments de tissu dans le milieu CGNP. Dissocier mécaniquement le tissu pour libérer les cellules.

Une fois que les débris se déposent, transférez le surnageant contenant les cellules dans un tube frais.

Centrifugez et retirez le surnageant avec les débris.

Remettez les cellules en suspension dans un milieu CGNP et ensemencez-les sur des puits à plaques multipuits recouverts de poly-D-lysine. Couver.

Les astrocytes se déposent et adhèrent fortement au revêtement de poly-D-lysine, par rapport aux CGNP.

Secouez la plaque et récupérez le surnageant contenant les CGNP. Centrifugez et retirez le surnageant.

Remettre en suspension les CGNP dans un milieu CGNP et les semer sur une plaque multipuits recouverte de poly-L-ornithine. Couver.

Les CGNP se fixent à la surface revêtue et prolifèrent, aidés par les composants du média et la poly-L-ornithine.

Transférez trois à cinq cervelous dans des tubes de 15 millilitres. Laver le cervelet avec du glucose HBSS avant la centrifugation. Centrifugez les tubes pour recueillir le tissu. Après le lavage final, homogénéisez le cervelet en pipetant doucement de haut en bas deux à trois fois avec une pipette de 1 millilitre jusqu’à ce que les fragments aient une taille de 0,5 à 1 millimètre cube.

Retirez délicatement tout le liquide jusqu’à ce qu’il reste 2,5 millilitres. Ensuite, ajoutez 0,05 % de trypsine dans le tube contenant du glucose HBSS contenant le cervelet et incubez le tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Retournez le tissu toutes les 1 à 3 minutes. Après l’incubation, arrêtez la digestion en ajoutant 5 millilitres de milieu de culture cellulaire GMPc ou CGM, et collectez le tissu par centrifugation comme précédemment.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez 1 millilitre de CGM. Triturez le tissu avec la pointe de la pipette de 1 millilitre, en évitant la formation de bulles d’air. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de CGM et incubez le mélange pendant deux minutes sur de la glace pour déposer les restes de tissus. Une fois que le tissu s’est stabilisé, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 2 millilitres de CGM au tissu résiduel et répétez la procédure de trituration avant de récolter le surnageant et de jeter les restes de tissu.

Regroupez les surnageants de chaque tube de tissu de 15 millilitres et centrifugez-les pour recueillir les cellules cérébelleuses. Remettre le granulé en suspension dans 10 millilitres de CGM. Étant donné que les astrocytes adhèrent plus rapidement et plus fort à la poly-D-lysine que les GMPc, ajoutez jusqu’à 4 millilitres de suspension cellulaire dans les puits des plaques à 6 puits recouvertes de poly-D-lysine et incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour éliminer les astrocytes.

Secouez l’assiette. Prélevez le surnageant dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugez-le comme précédemment. Remettez la pastille en suspension dans 10 millilitres de CGM et comptez les cellules avec une chambre de comptage Neubauer. Après 4 à 6 heures, les GMPc collés apparaissent ronds et proliférants. Ensemencez les cellules dans CGM sur des plaques recouvertes de poly-L-ornithine et incubez à 37 degrés Celsius, 5 % de CO₂ et 100 % d’humidité relative.