Génération de sphéroïdes à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Commencez par des colonies de cellules souches pluripotentes humaines ou hPSC attachées à un substrat approprié dans un milieu de culture.

Retirez le fluide. Ajoutez un milieu neuronal contenant des inhibiteurs spécifiques et incubez.

Ces inhibiteurs dirigent la maturation des hPSC vers une lignée neuronale, formant des colonies neuroectodermiques. Ce sont des précurseurs de petites structures sphériques appelées sphéroïdes.

Retirez le milieu et lavez-le avec un tampon à sel.

Incuber avec une enzyme digestive pour détacher les colonies de la plaque.

Ajouter le milieu neuronal pour arrêter l’activité enzymatique.

Récupérez les colonies et transférez-les dans un tube.

Laissez-les se déposer, puis jetez le surnageant.

Remettre les colonies en suspension dans un milieu neuronal contenant un facteur de croissance.

Transférez les colonies dans une plaque multi-puits et incuberez.

Ce facteur de croissance facilite l’auto-organisation et la multiplication des cellules neuroectodermiques, les amenant à former un sphéroïde.

Pour commencer, plaquez les colonies de hPSC sur une matrice de membrane basale qualifiée hESC à partir d’un puits d’une plaque de 6 puits à 60 % de confluence dans trois puits pour atteindre une densité de 20 % à 30 %, puis procédez à l’induction de colonies neuroectodermiques 2D.

Ajoutez quotidiennement dans chaque puits un milieu N2 frais complété par des inhibiteurs doubles de SMAD, pendant les 3 jours suivants. Pour générer des sphéroïdes neuroectodermiques 3D à partir de colonies neuroectodermiques 2D induites, retirez 2 millilitres de milieu N2 de la plaque à 6 puits et lavez une fois avec HBSS pour vous assurer que tout le milieu N2 est éliminé.

Ajouter 1 millilitre de dispase dans chaque puits contenant la colonie. Incuber la plaque pendant 20 à 25 minutes à 37 degrés Celsius et vérifier régulièrement le détachement de la colonie. À la fin de l’incubation, pour arrêter l’activité de l’enzyme dispase, ajoutez 1 millilitre de milieu N2 dans le puits. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 de gros calibre ou d’une coupelle de pipette P1000 modifiée avec des ciseaux stériles, transférez les colonies dans un tube de 15 millilitres et laissez les amas de colonies couler au fond du tube par gravité.

Ensuite, à l’aide d’une pointe de pipette standard P1000, retirez soigneusement le surnageant. Remplacez-le par 1 millilitre de milieu N2 frais et répétez le lavage trois fois pour assurer l’élimination complète de la dispase. Après avoir remis en suspension les amas cellulaires et le milieu N2, transférez la suspension cellulaire dans un puits d’une plaque à 6 puits et ajoutez 40 nanogrammes par millilitre de bFGF.