Coculture des neurones ganglionnaires rétiniens avec glie engainante olfactive

Prenez la rétine d’un rat, une couche sensible à la lumière de l’œil contenant des neurones ganglionnaires rétiniens, ou RGN.

Placez la rétine dans une solution saline équilibrée à froid pour éviter d’endommager les tissus.

Transférez la rétine dans une solution contenant de la protéase et de la DNase et coupez-la en petits morceaux.

Transférez le contenu dans un tube et incuber.

La protéase décompose la matrice extracellulaire et desserre les cellules, tandis que la DNase dégrade tout ADN contaminant.

Pipette de haut en bas pour disperser les amas de cellules.

Ajouter une solution inhibitrice pour arrêter l’action de la protéase.

Centrifugez les cellules pour les décanter. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de croissance approprié.

Ajoutez cette suspension cellulaire à la monocouche de cellules gliales engainantes olfactives ou OEG, un type de cellule gliale, et incubez.

Les RGN s’intègrent dans la monocouche OEG, établissant le modèle de coculture pour évaluer le potentiel neurorégénératif des OEG.

Placez la rétine dans une boîte de culture cellulaire P-60 préalablement préparée avec 5 millilitres d’EBSS froid. Ensuite, transférez-le dans une boîte de culture cellulaire P-60 avec de la papaïne reconstituée plus 50 microlitres d’APV et 250 microlitres de DNase plus 5 microlitres d’APV.

Coupez la rétine en petits morceaux avec un scalpel. Transférez les morceaux dans un tube en plastique de 15 millilitres et incubez-les pendant 30 minutes dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone en agitant toutes les 10 minutes. Dissociez les amas cellulaires en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire à 200 fois g pendant 5 minutes.

Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans l’inhibiteur de la protéase albumine ovomucoïde avec 150 microlitres de DNase et 30 microlitres d’APV.

Avec précaution, ajoutez la suspension cellulaire sur 5 millilitres d’inhibiteur de protéase ovomucoïde à l’albumine et répétez la centrifugation. Pendant la centrifugation, retirez complètement le milieu ME-10 d’une plaque OAG à 24 puits et remplacez-le par 500 microlitres de milieu NBB-27 par puits.

Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 2 millilitres de milieu NBB-27. Plaquez 100 microlitres de suspension de cellules rétiniennes dans chaque puits de la plaque M24 sur des lamelles monocouches traitées PLL ou OEG.

Maintenir les cultures à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant 96 heures dans le milieu NBB-27.