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Neurosciences
0 vues • 3:49 min • July 8th, 2025
Commencez par un muscle de tête de rat et coupez-le en fragments.
Ajoutez un cocktail d’enzymes protéolytiques et incubez en secouant doucement.
Les enzymes digèrent la matrice extracellulaire du tissu, relâchant les fibres musculaires.
Ajoutez des milieux contenant des protéines sériques pour inactiver les enzymes.
Transférez le tissu dans un tube, centrifugez-le et jetez le surnageant.
Remettez le tissu en suspension dans le milieu. Répétez la perturbation mécanique et la centrifugation deux fois pour obtenir une suspension homogène de cellules satellites, des cellules souches cruciales pour la réparation et la régénération musculaires.
Récupérez le surnageant contenant des cellules satellites.
Passer à travers une crépine cellulaire pour obtenir une suspension unicellulaire. Centrifugez, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu.
Placez des gouttes de la suspension cellulaire sur des puits de lames de chambre recouverts de protéines de matrice extracellulaire.
La surface revêtue facilite la fixation des cellules satellites. Ajouter du média dans les puits.
Les facteurs de croissance dans les milieux induisent la prolifération des cellules satellites et la différenciation en myoblastes - des précurseurs de cellules musculaires, qui prolifèrent et fusionnent pour former des myotubes multinucléés.
Les myotubes finissent par se transformer en fibres musculaires.
Pour isoler les cellules satellites, transférez chaque muscle dans des puits individuels d’une plaque à six puits, et coupez les tissus en petits morceaux de 2 millimètres, en prenant soin de ne pas trop hacher les muscles. Ensuite, incubez soigneusement les fragments de tissu dans 2,5 millilitres de solution de pronase à 0,1 % par puits à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes, en secouant doucement, toutes les 20 minutes.
Lorsque les faisceaux de fibres présentent une apparence relâchée, ajoutez 2,5 millilitres de DMEM, complétés par du sérum de cheval et des antibiotiques dans chaque puits, et transférez les tissus digérés dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Faites tourner les boues de tissu et décantez les surnageants. Ensuite, ajoutez 5 millilitres de fluide dans chaque tube et homogénéisez le tissu avec une pipette en plastique de 10 millilitres.
Faites tourner à nouveau les tissus et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 5 millilitres supplémentaires de fluide dans les tubes et triturez à nouveau les morceaux de tissu jusqu’à ce que les fragments passent facilement à travers la pipette.
Après une autre centrifugation, regroupez les surnageants dans les tubes correspondants appropriés et filtrez les suspensions cellulaires à travers des crépines de 40 micromètres dans des tubes individuels de 50 millilitres. Lavez les passoires avec 1 millilitre de DMEM pour une récupération cellulaire maximale. Ensuite, faites tourner les cellules. Remettez les granulés en suspension dans un milieu frais et comptez les cellules.
Pour cultiver les cellules satellites isolées, diluez ensuite les suspensions cellulaires à 1,5 x 103 cellules pour 10 microlitres de milieu de culture. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de cellules sur chaque point de gel de matrice extracellulaire préalablement préparé et incubez les gels à 37 degrés Celsius. Après six heures, ajoutez soigneusement 400 microlitres de milieu de culture à chaque point de gel et remettez les lames dans l’incubateur. Après trois jours, amorcez la différenciation des cellules avec l’ajout du milieu de culture approprié.