Neurogenèse induite par l’acide rétinoïque à l’aide de cellules de carcinome embryonnaire de souris

Prenez une suspension de cellules de carcinome embryonnaire de souris capable de se différencier en différents types de cellules.

Ensemencer des cellules sur une boîte de culture hydrophobe contenant du milieu et de l’acide rétinoïque.

couver. Les surfaces hydrophobes empêchent l’adhésion cellulaire, ce qui provoque la formation d’agrégats par les cellules.

L’acide rétinoïque pénètre dans les agrégats cellulaires, déclenchant des voies de signalisation et provoquant la différenciation en cellules progénitrices neuronales.

Après l’incubation, recueillir les agrégats cellulaires.

Jetez le support.

Ajouter un milieu contenant de l’acide rétinoïque et ensemencer les agrégats dans une boîte de culture hydrophobe.

couver. L’acide rétinoïque facilite la différenciation cellulaire soutenue en neurones.

Récupérez les agrégats et retirez les supports.

Ajouter une enzyme protéolytique pour perturber les adhésions cellule-cellule au sein des agrégats.

Ajoutez un milieu contenant du sérum pour arrêter l’activité enzymatique.

Dissocier mécaniquement les agrégats, formant une suspension neuronale.

Centrifugez et jetez le surnageant riche en enzymes.

Remettez les neurones en suspension dans un milieu et ensemencez-les sur une plaque multipuits adhérente contenant un milieu.

couver. Les neurones adhèrent à la plaque et mûrissent, étendant de longues projections.

Pour la génération d’agrégats, commencez par ajouter 10 millilitres de milieu de différenciation complété par 5 microlitres d’AR dans une boîte de culture non traitée de 100 millilitres. Ensemencez 1 million de cellules dans la boîte de culture et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours afin de favoriser la formation d’agrégats.

Après l’incubation, à l’aide d’une pipette de 10 millilitres, aspirez le milieu contenant les agrégats et transférez-le dans un tube de 15 millilitres à température ambiante. Attendez 1,5 minute que les agrégats se déposent au fond, puis jetez le surnageant.

Ajouter 10 millilitres de milieu de différenciation frais complété par 0,5 AR micromolaire. Semez délicatement les agrégats dans une nouvelle boîte de culture non traitée de 100 millimètres et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours.

Pour commencer, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les agrégats de cellules dans un tube de 15 millilitres. Attendez 1,5 minute à température ambiante pour que les agrégats se déposent au fond, puis jetez le surnageant. Lavez les agrégats avec du sérum et du DMEM sans antibiotiques. Attendez que les agrégats cellulaires se déposent au fond. Jetez le surnageant et ajoutez 2 millilitres de trypsine EDTA à 0,25 %.

Incuber le tube dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en tapotant toutes les deux minutes pour maintenir les cellules en suspension. Ensuite, ajoutez 4 millilitres de milieu d’entretien afin d’arrêter l’activité de la trypsine, et pipetez de haut en bas 20 fois à l’aide d’une pipette de 1 millilitre.

Enfin, centrifugez les cellules à 200 fois g et à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 5 millilitres de milieu d’entretien. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer le numéro de cellule et procédez au placage des cellules. Pour plaquer les cellules, ajoutez d’abord 3 millilitres par puits de milieu d’entretien à une plaque de culture à six puits. Ensuite, ensemencez les cellules à une densité de 500 000 par puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.